[发明专利]一种利用原核表达系统表达纯化多肽的方法

权利要求书

1.一种利用原核表达系统表达纯化多肽的方法，其特征在于所述方法为：(1)将多肽单元的C端加上肠激酶酶切位点，N端加上组氨酸标签，获得重组多肽单元；然后从N端到C端依次将若干个重组多肽单元串联，获得重组蛋白的氨基酸序列；(2)将重组蛋白的编码基因导入大肠杆菌，构建重组大肠杆菌；(3)重组大肠杆菌诱导表达后，湿菌体用缓冲液重悬破碎后，提取重组蛋白；(4)重组蛋白采用肠激酶处理后，获得多个多肽单元。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述多肽单元的氨基酸个数为5～9。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)重组多肽单元有12-15个。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述多肽单元为棕榈酰五肽-3，氨基酸序列为KTTKS；所述重组蛋白由15个多肽单元进行串联。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述多肽单元为棕榈酰六肽-6，氨基酸序列为EEMERR；所述重组蛋白由12个多肽单元进行串联。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述多肽单元为九肽-1，氨基酸序列为MPFRWFKPV；所述重组多肽单元由12个多肽单元进行串联。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述肠激酶酶切位点是指氨基酸序列DDDK。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述重组大肠杆菌按如下方法构建：将重组蛋白编码基因与pET22b表达载体连接，37℃共孵育，获得重组表达载体；将重组表达载体加入T4 DNA聚合酶，20℃处理2分钟，80℃变性5分钟，50℃退火10分钟，然后转化到大肠杆菌DH5α，用含100μg/mL氨苄青霉素钠的LB平板筛选挑出阳性克隆，获得含重组蛋白编码基因的重组大肠杆菌。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述重组蛋白提取方法为：

将重组大肠杆菌诱导表达后湿菌体用PBS缓冲液重悬制成菌悬液，加入含1mg/ml溶菌酶的Triton X-100细胞裂解液，在冰水混合物环境下、400W、2s超声、5s间歇，全长45min，保护温度40℃超声破菌，12000rpm离心20min，收集上清液；所述重悬用PBS缓冲液体积用量以湿菌体重量计为6mL/g，所述细胞裂解液体积用量以湿菌体重量计为1mL/g；

用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱柱材，然后将柱材和上清液以体积比1:5混合，冰上轻摇30min，以2ml/min的速度上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液以2ml/min的速度洗脱1倍柱体积去除杂蛋白，在柱上加入20μL具有His标签的PPase蛋白酶，于冰上轻摇2小时，用PBS溶液以2ml/min的速度洗脱2倍柱体积，收集所有流出液，采用截留分子大小为16kD的透析袋，以0.05mol/L pH7.0 PBS为透析液透析过夜，取截留液，获得重组蛋白。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述多肽的制备方法为：(1)取截留液，加入肠激酶，10X缓冲液，终浓度1mM CaCl₂，体积终浓度0.1％Tween-20，室温下反应16h，获得肠激酶处理液；所述肠激酶加入量以截留液体积计为20U/ml；所述缓冲液与截留液体积比为0.1:1；所述10X缓冲液为50mM Tris-HCl，pH 8.0；(2)向肠激酶处理液中加入等体积4度饱和硫酸铵，以50000r/min的速度离心30分钟，弃上清，加入与截留液等体积的缓冲液，在震荡器上使沉淀溶解，再在20000r/min下离心10分钟取上清，-40℃冻干，获得多肽；所述缓冲液为0.5M Tris-HCl，pH 8.0，10mM CaCl₂，1％Tween-20。