[发明专利]一种细胞处理的方法及其在甘露聚糖肽合成中的应用

说明书

本发明公开一种细胞处理的方法及其在甘露聚糖肽合成中的应用，通过加入不同种类的试剂，同时采用微波协同超声波辅助处理细胞的方式转化合成甘露聚糖肽。将试剂的浓度控制在57 mg/L~398 mg/L范围内，并于发酵后的第0~40个小时加入发酵培养基中进行处理，结合控制微波协同超声波辅助处理过程中的处理时间、中间间隔次数、间隔时间、功率等参数获得细胞，随后将处理后的细胞应用于发酵合成甘露聚糖肽，对提取所得的甘露聚糖肽利用萘酚‑硫酸法检测其产量。相比于未经处理的细胞，处理后的细胞在发酵合成甘露聚糖肽的过程可显著将其产量提升至少85%以上。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及一种细胞处理的方法及其在甘露聚糖肽合成中的应用。

背景技术

甘露聚糖肽（曾用名：多抗甲素）是由甲型溶血性链球菌经深层发酵、分离纯化所得糖肽类物质。作为一种新型的生物免疫增强剂，甘露聚糖肽在临床上常用于治疗免疫功能低下或者免疫障碍性疾病，以及肿瘤的辅助治疗。

目前，甘露聚糖肽的研究主要集中在发酵过程的调控以及临床应用。专利号CN104404114 B公开了一种甘露聚糖肽的发酵工艺及其应用，通过改进菌种的接种、浓缩和活性炭处理等过程，可显著降低了甘露聚糖肽中内毒素的含量。《长江大学学报（自科版）》，2017，14：2报道了发酵温度和pH对甘露聚糖肽合成的影响，发现两段式组合调控发酵比恒定温度和pH模式下产量可提升35.9%。CN 101186941 B公开了一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，经过对提取的粗品甘露聚糖肽进行分离、水解以及超滤等可获得纯度高达90~98%的甘露聚糖肽产品。申请号03117579.1公开了一种甘露聚糖肽及其制备工艺和用途，通过调控发酵过程中的pH和提取过程中乙醇的浓度，可将甘露聚糖肽的重均分子量和比旋光度控制在一定范围内。《食品工业科技》，2015，36（05）：185-188+197指出酵母膏添加量的调控不仅能够缩短菌株生长的延滞期，还可以影响其对甘露聚糖肽的代谢合成。

本发明的重点在于先将细胞进行处理，随后应用于发酵生产甘露聚糖肽，相比于未经处理的细胞，不同种类的处理试剂的使用在不影响细胞内活性物质甚至提升细胞内酶活性的条件下，进一步结合采用微波协同超声波辅助处理的手段，不仅能够加剧细胞内的分子运动，还能增强试剂对细胞的处理程度，更加有效的实现生物催化的效率以及甘露聚糖肽的提取效率的显著提升，最终将甘露聚糖肽的产量提升至少85%以上，进而在后续的分离纯化过程中减少损失量。

发明内容

本发明提供一种细胞处理的方法及其在甘露聚糖肽合成中的应用。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

在摇瓶种子培养基中先对甲型溶血性链球菌进行高密度培养，提高菌株的转化活力，所述的甲型溶血性链球菌为甲型溶血性链球菌H1S-33和/或甲型溶血性链球菌CMCC32205，随后将菌株转接入发酵培养基进行细胞处理。

进一步，处理所用的试剂为洋地黄皂苷、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯酚醚、新吉尔灭、β-环糊精、桃胶中的一种或多种；并采用微波协同超声波辅助处理细胞。

进一步，试剂对于细胞的处理时间为0.5~50 h，浓度为57 mg/L~398 mg/L；采用微波协同超声波辅助处理细胞的时间为0~300 秒，中间间隔0~10次，每次间隔时间0~30秒，功率为200~800 W。

进一步，细胞处理时添加试剂的时间为发酵开始后的第0~40个小时。

进一步，细胞经上述处理后，甘露聚糖肽的产量能提升至少85%以上。

进一步，经此处理的细胞能够应用于发酵制备甘露聚糖肽。