[发明专利]利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺

权利要求书

1.一种制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述方法包括：

以美国标准菌种保藏中心（ATCC）编号为CCL-81.5的Vero细胞为病毒培养的宿主，接种狂犬病病毒rPV-2061株，培养，制备成狂犬病病毒疫苗；所述培养采用无血清培养基培养；

Vero细胞培养的工艺为：在生物反应器内无血清培养基灌流培养Vero细胞至0.6~0.7×10⁷cells/ml，开始病毒接种；所述生物反应器为固定床生物反应器；

病毒接种的工艺为：将狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接种到细胞，培养6h以上，开始使用无血清病毒维持液灌流培养；

所述无血清培养液的组成为：

Vero细胞无血清培养基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L；

所述无血清病毒维持液的组成为：

Vero细胞无血清培养基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L，碳酸氢钠2~3g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）细胞培养：在生物反应器内无血清培养基灌流培养Vero细胞至0.6~0.7×10⁷cells/ml，开始病毒接种；

（2）病毒接种：将狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接种到细胞，培养6h以上，开始使用无血清病毒维持液灌流培养；

（3）收毒：病毒接种后，从第3天开始收获病毒，得病毒收获液；

（4）灭活：使用β-丙内酯灭活病毒；

（5）酶切：使用核酸酶对Vero细胞宿主DNA进行酶切；

（6）纯化：分子筛层析纯化病毒；

（7）配制原液：加入终浓度0.5~3%（m/v）人血白蛋白和终浓度3~5%（m/v）的麦芽糖作为稳定剂，即为原液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）的β-丙内酯用量为病毒液的1/4000。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）酶切条件为：45~180 U/ml的非限制性核酸内切酶，于5~37 ℃酶切24 小时以上。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）的分子筛层析的填料是琼脂糖凝胶4FF，流动相为pH 7.4~7.8的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（7）的人血白蛋白用量为3%（m/v）。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（7）的麦芽糖的用量为5%（m/v）。

8.如权利要求2~7任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括向原液中加入冻干保护剂进行冷冻干燥；

所述冻干保护剂为含有3~5%（m/v）麦芽糖、0.5~3%（m/v）人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为7.2~8.0。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述冻干保护剂含有5%（m/v）麦芽糖、3%（m/v）人血白蛋白。