[发明专利]聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶，其结构式如下：

其中，GPX表示重组谷胱甘肽过氧化物酶，mPEG表示活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯中的单甲氧基聚乙二醇部分。

2.权利要求1所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其步骤如下：

(1)重组谷胱甘肽过氧化物酶的获取

制备重组谷胱甘肽过氧化物酶，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹鉴定重组谷胱甘肽过氧化物酶靶蛋白；

(2)修饰反应及分离纯化

以平均分子量2～30kD的活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂，与步骤(1)得到的重组谷胱甘肽过氧化物酶在4～37℃、pH6.0～9.0条件下进行10～60min的共价偶联反应，重组谷胱甘肽过氧化物酶与修饰剂的摩尔比为1：5～60，然后加入终止剂甘氨酸终止反应；再将共价偶联反应所得混合液用阴离子交换层析色谱分离纯化，采用盐浓度梯度洗脱方式洗脱目标产物，将含有目标产物的洗脱液收集透析除盐，然后将目标产物冻干，即得到聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶，最后用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考蓝染色和碘染色两种染色方式鉴定目标产物。

3.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯的平均分子量为2～20kD。

4.如权利要求3所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯的平均分子量为5～20kD。

5.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：重组谷胱甘肽过氧化物酶与修饰剂的摩尔比为1：5～50。

6.如权利要求5所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：重组谷胱甘肽过氧化物酶与修饰剂的摩尔比为1：10～30。

7.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：共价偶联反应的时间为20～30min，温度为4～20℃，pH为7.4～8.5。

8.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯和终止剂甘氨酸的摩尔比为1：1。

9.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于：阴离子交换层析色谱分离纯化所使用的离子交换层析介质为DEAE-SEPHACEL层析介质，使用pH8.95、10mmol/L Tris.HCl平衡缓冲液平衡色谱柱内的层析介质，将反应液加入已平衡的含DEAE-SEPHACEL层析介质的色谱柱内，再用10mmol/L Tris.HCl平衡缓冲液洗脱未挂柱物质，出水口连接核酸蛋白检测仪，色谱工作站监测核酸蛋白检测仪在280nm的紫外吸收；待基线平稳后，采用盐浓度梯度洗脱方式洗脱目标产物，洗脱缓冲液为pH8.95、含有1mol/L氯化钠的10mmol/L Tris.HCl缓冲液。

10.权利要求1所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备抗氧化药物、保健品或化妆品方面的应用。