[发明专利]铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用

说明书

本发明涉及一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用，该核酸适配体ETA01的序列包括：5'‑TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCAT CTGAGGGTGGTCTTCGCA‑3'。本发明的核酸适配体ETA01能高亲和力、高特异性地与铜绿假单胞菌外毒素A结合，以核酸适配体ETA01作为铜绿假单胞菌外毒素A的识别元件，建立铜绿假单胞菌外毒素A的检测方法、制备检测试剂、研制外毒素A拮抗药物，可用于铜绿假单胞菌感染的诊断、治疗以及铜绿假单胞菌外毒素A生物学功能研究等应用领域，具有方法简便、快速、特性好等优点。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用。

背景技术

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆状细菌，在各种环境条件下具有最佳适应性。铜绿假单胞菌虽为专性需氧菌，也可以通过硝酸盐或其他电子受体进行厌氧呼吸。因此，铜绿假单胞菌在土壤、水或污水以及人类、动物或植物宿主中广泛存在，并在全世界广泛传播。健康人被铜绿假单胞菌感染是非常罕见的，但作为一种机会致病菌，它经常在免疫功能低下的囊性纤维化、烧伤或艾滋病患者中寄生。感染范围从内膜炎、心内膜炎、脑膜炎和败血症到慢性肺部感染。由于铜绿假单胞菌天然对不同抗生素或化疗药物耐药，其根除困难且死亡率高。

铜绿假单胞菌通过多种毒力因子附着在组织表面，破坏组织进行扩散和营养供应，提高其存活率。铜绿假单胞菌的外毒素A（Exotoxin A，ETA）是临床大多数铜绿假单胞菌产生的胞外酶。它是一种单链多肽，分子量66 kDA，含有A和B片段，分别介导酶促和细胞结合功能，属于单-ADP-核糖转移酶家族。外毒素A催化烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸的二磷酸腺苷-核糖基向延伸因子2的转移，导致后者失活并抑制蛋白质的生物合成。外毒素A是一种强效细胞毒素，对多种动物都是致命的，包括灵长类动物等。外毒素A是铜绿假单胞菌感染时在体内产生的，它通过抑制蛋白质合成、直接影响细胞病变和干扰宿主细胞免疫功能而引起疾病。检测外毒素A可作为铜绿假单胞菌感染诊断和病情检测的指标，拮抗外毒素A的毒性作用可为耐药性铜绿假单胞菌的治疗提供帮助。

目前，国内外针对铜绿假单胞菌外毒素A的检测研究大多数采用的是分子生物学技术，其中以PCR、荧光实时定量PCR等的运用较多。虽然直接检测铜绿假单胞菌外毒素A更加方便、快捷，但由于抗体特异性问题，只有极少数的免疫学技术应用于这方面。

核酸适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），从核酸分子随机文库中筛选得到的寡核苷酸片段。核酸适配体与靶标的结合具有高亲和力、高特异性等特点。作为核酸类分子，核酸适配体可直接合成并进行各种化学修饰，具有成本低、制备快等优点。将核酸适配体作为靶标的识别元件，已应用于各种靶标的快速、准确检测。已有研究将核酸适配体作为铜绿假单胞菌的识别元件，建立了可检测铜绿假单胞菌菌体的传感器、荧光杂交等新方法（Mikrochim Acta。2018，185：377）。如能利用核酸适配体的优势，建立快速、准确的铜绿假单胞菌外毒素A的检测方法，将具有广阔的临床和基础研究价值。

本发明提出一种特异识别铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01。ETA01是以大肠杆菌表达的铜绿假单胞菌外毒素A为靶标，通过SELEX技术从核酸分子随机文库中体外人工筛选并经序列优化后获得。核酸适配体ETA01能够特异识别铜绿假单胞菌外毒素A，而不结合其他铜绿假单胞菌毒素。目前尚未见以铜绿假单胞菌外毒素A为靶标筛选核酸适配体并应用的报道。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种核酸适配体ETA01，其能够特异性识别铜绿假单胞菌的外毒素A。

具体技术方案如下：