[发明专利]目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。所述目的基因多拷贝整合的方法包括(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。本发明将CRISPR‑Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法。

本申请是分案申请，其母案是发明名称为“目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法”的发明专利申请，其申请号为201810054262.4，申请日为2018年01月19日。

技术领域

本发明总地涉及生物技术领域，具体来说涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。

背景技术

酵母是一种单细胞真核生物，其作为表达系统，具有以下优势：具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰系统，利于外源蛋白的稳定高效表达；是生物安全性微生物，不产生内毒素，合成的生物产品具有很高的安全性。目前，酵母已广泛用于生物制剂的合成，如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、汉逊酵母Hansenula polymorpha、毕赤酵母Pichiapastoris等。

汉逊酵母作为甲醇型酵母的模式菌株，在基础研究和工业应用领域发挥着重要作用。作为生产多种重要生物制剂的微生物细胞工厂，汉逊酵母具有高效、安全和经济等诸多优势，主要体现在以下几个方面：1)易于目的基因的高拷贝整合，通过非同源末端连接机制能够随机整合超过100个拷贝的目的基因，易于实现外源蛋白的高效表达；2)是生物安全性微生物(GRAS)，其蛋白糖基化水平与哺乳动物细胞相近，使得汉逊酵母生产的蛋白制剂具有较高的生物安全性；3)是最耐热的酵母，最高生长温度可以达到50℃，由此可以降低工业发酵的冷凝成本，适合大规模工业生产。然而，汉逊酵母缺少稳定的表达质粒，因此，需要通过在基因组上稳定整合目的基因。

酿酒酵母是一种具有生物安全性的模式真核生物，其遗传背景清晰，发酵方法成熟，已被广泛应用于多种生物制剂的合成，如青蒿素、紫杉醇、人参皂苷、番茄红素和β-胡萝卜素等。

rDNA是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列。在酵母细胞中一般存在高拷贝的rDNA单元(也被称作rDNA重复单元)串联重复，所有rDNA单元相同，均由两个转录区5S和35SrDNA序列以及两个非转录区NTS1和NTS2组成。如在汉逊酵母中(图1),大约50～60个rDNA单元在II号染色体上串联重复，一个rDNA单元长达8kb左右；在酿酒酵母中，大约150～200个rDNA单元在第Ⅻ号染色体上串联重复，每个rDNA单元长达9.1kb左右。将rDNA作为整合位点以提高目的基因整合拷贝数的应用策略在多种酵母中均已展开研究，但其整合稳定性很难控制，目的基因的拷贝数会随着酵母繁殖世代的增加而减小或表达量降低，有研究指出目的基因的稳定性与整合载体的大小有关，即整合载体的大小不能超过rDNA单元的大小。

此外，目前文献报道的高拷贝整合目的基因的方法，一般均需采用遗传标记基因以指示目的基因是否整合至宿主细胞。因此在整合目的基因的同时，不可避免地在宿主细胞的基因组上整合多拷贝的遗传标记基因。尤其是在整合多个不同目的基因时，还需要选择多个不同的遗传标记基因以指示不同的目的基因。这样不但影响后续的遗传操作，而且带有遗传标记基因的菌株，尤其是带有抗生素抗性基因的菌株还可能存在生物安全性问题。