[发明专利]检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域的病毒检测方法，具体涉及一种检测野生型腺相关病毒的通用引物对/组合、检测方法及其应用。本发明提供一种可用于检测12种血清型的野生型腺相关病毒的通用引物对/组合，利用该引物组合，可实现12种血清型的野生型腺相关病毒的qPCR检测。相比传统的野生型腺相关病毒PCR检测方法，利用该引物组合的qPCR检测方法可有效提高检测灵敏度和准确性，更快捷、可定量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域的病毒检测方法，具体涉及一种检测野生型腺相关病毒的通用引物、检测方法及其应用。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)属于微小病毒科依赖病毒属B19家族，无包膜，含线性单链的脱氧核糖核酸—约4.7kbp，含rep和cap两个开放阅读框，两端分别有末端重复序列(ITR)。AAV颗粒呈二十面体，直经约20nm，分子量约为5.5-6.2×10⁶Da。目前没有直接证据表明AAV与人类疾病相关。AAV在宿主中的复制需要宿主细胞或其他病毒的协助才能完成，如腺病毒和疱疹病毒，因此被称为腺相关病毒。AAV是作为腺病毒的污染成分被发现的，FDA在《人体细胞和基因治疗指导原则》中对腺病毒生产的AAV污染残留的质量控制有明确规定。目前已发现的不同血清型、突变型AAV种类达上百种。过去，国内外在质量控制中主要采用PCR扩增常见腺相关病毒1-8血清型的保守序列来进行质量控制。如高凯等(高凯，毕华，丁有学等.重组复制型溶瘤腺病毒p53的质量控制方法.药学学报，2011,46(12)：1476-1482)，使用引物组合AAV-F1/R1对重组复制型溶瘤腺病毒p53中的AAV残留进行检测；李永红等(李永红，饶春明，赵阳等.重组腺病毒人内皮抑素的质量标准研究.中国肿瘤生物治疗杂志，2005,12(2)：138-142)使用引物组合Pan1/2对重组腺病毒人内皮抑素中的AAV残留进行检测。下载NCBI数据库中的AAV1-AAV12的序列进行比对与分析，推测，AAV-F1/R1对AAV3、5、11、12的扩增效率较低，Pan1/2对AAV3的扩增效率较低。

目前，尚未发现可快速高效、定量的检测12种血清型的野生型AAV(AAV1-12)的方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种可用于检测12种血清型的野生型腺相关病毒的通用引物对/组合，利用该引物组合，可实现12种血清型的野生型腺相关病毒的qPCR检测。相比传统的野生型腺相关病毒PCR检测方法，利用该引物组合的qPCR检测方法可有效提高检测灵敏度和准确性，更快捷、可定量。

为此，本发明第一方面提供一种检测野生型腺相关病毒的通用引物对/组合。根据本发明的实施例，所述通用引物对/组合包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列为5’-tggtgggaggagggVaagatgac-3’，其中简并碱基V为C、G或A；所述第二引物的序列为5’-cRcacatgttKgtRttgg-3’，其中简并碱基R为G或A，简并碱基K为G或T。

国内外在腺病毒质量控制中主要采用PCR扩增常见腺相关病毒1-8血清型的保守序列来进行质量控制。目前尚未发现可快速高效、定量的检测12种血清型的野生型AAV(AAV1～12)的方法。而本发明提供的检测野生型腺相关病毒的通用引物，可同时用于检测12种血清型的野生型AAV。基于该引物组合开发的SYBR green I qPCR检测方法，其灵敏度可达100个拷贝/反应，比此前传统的PCR检测方法提高至少1个数量级。

本发明第二方面提供一种试剂盒。根据本发明的实施例，包含第一方面所述的通用引物对/组合。

本发明提供的包含所述第一引物和第二引物的试剂盒，可用于检测12种野生型腺相关病毒。

本发明第三方面提供第一方面所述的通用引物对/组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测野生型腺相关病毒。根据本发明的实施例，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。