[发明专利]一种用于肥胖基因突变检测的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测肥胖基因突变位点的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括肥胖基因85个常见突变位点区域进行分组扩增的引物。本发明所述试剂盒可实现3孔检测肥胖基因85个突变位点，灵敏度高、特异性强、准确性高，并且操作简便、低成本、高通量，检测快速，结果自动判读，易于推广应用。本发明基于中国人群GWAS研究及数据库开发了一套软件报告系统，根据PRS模型计算，给出精准的肥胖遗传风险，计算三大营养素个体化差异以及运动受益，给出精准的体重管理建议，让肥胖者轻松了解自己的肥胖类型，为精准减肥提供指导，实现对症减肥、科学减肥。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)平台的用于肥胖基因突变检测的试剂盒。

背景技术

肥胖目前在全世界呈流行趋势。肥胖既是一个独立的疾病，又是诱发2型糖尿病、心血管病、高血压、中风和多种癌症的危险因素，被世界卫生组织列为导致疾病负担的十大危险因素之一。我国目前体重超重者已达22.4％，肥胖者3.01％，目前我国肥胖人群的比例一直在持续上升，肥胖不仅是个人美观的问题，而且会引发各种疾病，如肥胖除了会引起三高(高血脂、高血糖、高血压)也会引起心血管疾病、中风、糖尿病、痛风、睡眠呼吸中止症等，甚至包括大肠癌、乳腺癌食道癌等风险，因此肥胖人口的增加是一项值得国人重视的健康警讯，预防和控制肥胖症已成为刻不容缓的任务。

肥胖与遗传因素密切相关，根据统计，父母单方面肥胖，子女发胖的几率是40％，是一般人的4倍。如果父母都胖，则几率高达80％，是一般人的8倍。除遗传因素外，饮食不当，缺乏运动是造成肥胖的重要原因。

目前，用于肥胖基因突变检测的方法和产品主要有荧光定量熔解曲线法、Sanger测序法、高通量测序法。荧光定量熔解曲线法单孔检测通量有限，只能检测少数位点已知突变，每个位点的每种突变基因型均需设计特异引物；覆盖常见位点需要多孔并且每孔进行多重检测，多重探针设计要求高，技术难度大，检测探针成本高昂，结果判读手工操作，易错判；Sanger测序法是序列金标准，但是流程长，操作复杂，且需要手工判读每一个位点，覆盖常见位点需要多孔检测，成本高，通量低；高通量测序法虽然可一次检测覆盖肥胖所有基因位点，但其仪器和检测试剂成本高昂，检测样本数量少的时候会造成浪费，导致成本更高，且体系所需核酸样本量高(50ng以上)；高通量测序检测流程长达3-5天，操作复杂，且需要专业的生信分析人员分析数据，结果判读困难，因此无法作为筛查项目在全国各级地方中小医院大规模推广应用。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有对应关系，并以质/荷比计算分子量。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，最后根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF质谱很适合用于对蛋白质、多肽和多糖、核酸等生物大分子的研究。因其具有测定质量范围宽、灵敏度高、速度快、精确度高及对盐的耐受性较好等优点，已广泛应用于蛋白质及多肽的分子量和序列测定。

本发明的肥胖基因位点进行MALDI-TOF质谱检测存在的难点：各检测位点的扩增引物(即多重PCR引物)设计，以及延伸引物设计，复合扩增时各引物比例，体系中各成分最适浓度等，都需要进行优化，最终实现符合实际应用要求的位点内、组内及组间均衡性与稳定性，有些位点序列结构特殊，或GC含量较高，较难设计多重PCR的引物。

发明内容