[发明专利]一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法

说明书

提供了一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，将模拟干细胞巢的明胶、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制成胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中，胶液在分散剂中形成微球后转入到碳酸钠或碳酸钾溶液中进行交联定型，再转移到稀酸溶液中溶解纳米碳酸钙，微球脱除纳米碳酸钙后在微球内部形成大量孔道，可用于干细胞3D培养。三偏磷酸钠交联剂通过磷酸酯键完成明胶及氨基多糖中羟基的交联，可以用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和地裂解多孔载体并释放其中培养的干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法。

背景技术

干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2D培养与3D培养两大类。2D培养主要通过增大培养皿进行，批量换液、扩散法供气。3D培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3D培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。

干细胞3D培养载体是影响干细胞3D培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3D培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3D培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。

同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这类干细胞分离方法对干细胞的损伤极大，干细胞产业急需可以温和裂解的干细胞培养载体，在载体裂解过程中最大限度地减少对干细胞的损伤。能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、仿真干细胞生巢设计的、对干细胞友好的新型干细胞3D培养载体已经成为干细胞产业发展的瓶颈。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸将碳酸钙溶解除去并形成载体内部孔道，整个干细胞3D培养用载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3D培养载体内有机溶剂残留问题。同时，根据干细胞巢组成中胶原蛋白、氨基聚糖等都具有多羟基的结构特点，开发了以三偏磷酸钠在碱性条件下通过大量的磷酸酯键交联干细胞巢仿真组分的方法，制备的干细胞3D培养用多孔微载体能够用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和裂解，有效避免多孔载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。

本发明克服现有干细胞培养载体的不足，发明的仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法的具体步骤如下：

S1 将模拟干细胞巢的明胶、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制备胶液，在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中；

S2 将含纳米碳酸钙的胶液在分散剂中形成微球；

S3将微球转到碳酸钠或碳酸钾溶液中交联定型；

S4 将完成交联定型的微球转移到稀酸溶液中，利用稀酸脱除纳米碳酸钙并在微球中形成大量孔道；

S5将多孔微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。

优选地，使用三偏磷酸钠为交联剂，通过磷酸酯键完成羟基交联，形成三维网状结构用于干细胞3D培养，且能够用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和裂解。

优选地，S1使用纳米碳酸钙为致孔剂，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。

优选地，S2中可以滴注法制作胶液微球，控制胶液微球的大小0.1-1mm，其制作中使用的分散剂可以选用液体石蜡，也可以用其他与水不混溶的分散剂。也可以使用离心分散法、高速搅拌法制作胶液微球。

优选地，将微球置于碱性溶液中交联定型，优选使用碳酸钠或碳酸钾溶液。

优选地，利用稀酸脱除载体微球内包裹的纳米碳酸钙，形成多孔微球载体。