[发明专利]去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用

权利要求书

1.去饱和酶Des在提高芽胞杆菌聚γ-谷氨酸的产量中的应用，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）或枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）；所述的去饱和酶Des为上述芽胞杆菌中对应的去饱和酶Des。

2.根据权利要求1所述的应用，其应用过程是利用表达载体将芽胞杆菌中对应的des基因在芽胞杆菌中过表达，将得到的重组菌株用于发酵生产聚γ-谷氨酸。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HZ-12，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）BS168，对应的去饱和酶Des的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的应用，编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求2所述的应用，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：40~90g/L葡萄糖，4-10g/L柠檬酸钠，4-10g/L NaNO₃，4~10g/L NH₄Cl，0.4~1g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.4~1g/L MgSO₄·7H₂O，0.4~1g/L ZnSO₄·7H₂O，0.075~0.15g/L MnSO₄·H₂O，0~1g/LCaCl₂，pH6.5~7.2。

6.根据权利要求2所述的应用，所述的表达载体为pHY300PLK。

7.根据权利要求2所述的应用，所述的重组菌株的构建过程包括：

（1）PCR扩增出芽胞杆菌的des基因；

（2）通过重叠延伸PCR将des基因与RBS6启动子和淀粉酶终止子连接到一起，构建完整的des表达元件；

（3）采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

（4）将步骤（3）得到的酶切目的片段和线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到过表达质粒pHY-des；

（5）将过表达质粒pHY-des转入芽胞杆菌中筛选得到阳性转化子，即得。