[发明专利]一种可缓释外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种可缓释外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及其应用，同传统方法相比，本技术的实施方案实现了可以在冰冻环境下长期保存，在保证支架结构不被破坏的前提下，减缓释放速率，使支架降解与外泌体释放的速率同步展开，仅通过调控丝素蛋白冷冻海绵的降解速率，便可以调控外泌体的释放速率，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物支架领域，特别是涉及一种外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及其应用。

背景技术

外泌体作为一种由细胞内体通过多种转运机制释放至胞外的脂质双分子层囊泡，已有大量研究对外泌体的结构和功能进行探索。外泌体直径在50-100 nm之间，形态多为球形。通过内体膜向内萌芽形成多囊泡体后，多囊泡体与质膜融合，从而将外泌体释放到细胞外环境。外泌体作为重要的调控细胞间通讯的纳米囊泡，其携带的分子成分包括脂质（前列腺素、磷酸激酶C/D等），蛋白质（跨膜蛋白、脂锚定膜蛋白、外部周围膜蛋白、内部周围膜蛋白等）和核酸（DNA、RNA），其中外泌体携带的RNA几乎涵盖所有RNA种类。外泌体的成分具有选择性包裹的特点，包裹的蛋白和miRNA不仅受细胞种类、细胞状态影响，同时受细胞所处的微环境所调控。同现有的细胞疗法相比，外泌体具有更小的炎症反应，在储存的过程中还可以保留生物化学活性，因此在组织工程领域已有越来越多的研究利用外泌体进行研究。

由于外泌体的产能有限，目前尚无法大规模量产，因此如何提高外泌体治疗时的有效浓度，对外泌体的临床转化有重要的应用意义。同以往直接进行外泌体注射的方法相比，近几年已经有许多研究团队通过对外泌体控释的载体形式进行设计来实现对外泌体释放速率的调控。常见的释放策略包括以下几类：①外泌体与水凝胶前驱体混合，通过交联实现负载；②水凝胶浸泡在溶剂中去除结合水，再浸泡在含有外泌体的溶液中溶胀，从而吸附外泌体；③利用电荷吸附的方式将外泌体吸附在支架表面。这些方法虽然都可以减缓外泌体在支架中的释放速率，但是同组织生长愈合需要的时间相比仍然较快。根据我们对已有文献的统计，目前对外泌体体外释放的降解曲线的实验都在PBS水环境下进行，且释放的半衰期大多都在10天以内。在进行组织的损伤修复实验中，支架植入体内需要面对一系列排异反应，以及由多种胶原酶介导的酶解释放反应，这会大幅提高外泌体的释放速率。基于目前控释策略制备的支架，在早期炎症反应阶段（两周左右）就会释放50%甚至更多的外泌体，这会导致外泌体有效浓度的显著下降，不利于软骨的再生。如何通过对外泌体的缓释策略进行研究，实现外泌体的长效释放，并且能够伴随支架的降解持续对组织的生长过程进行调控，是目前亟需解决的一个难点。

目前现有技术中所公开的用于外泌体缓释的生物支架具有如下缺点：

1、无法长期保存。水凝胶在低温保存的时候由于冰晶的形成，凝胶结构会被破坏，融化后出现结构坍塌；

2、现有的技术不论是水凝胶包裹还是溶胀吸附还是电荷吸附，外泌体的释放都是以扩散的形式为主，释放速率快。10天水环境的释放量几乎都超过50%，部分甚至达到90%。面对大面积组织修复以及血供匮乏的组织修复，通常需要数月的时间，这导致外泌体释放过快，无法实现后期调控；

3、在释放完成后，支架依旧存在，导致其生物调控的功能消失，只能提供力学支撑。随着支架开始出现降解，又会有局部炎症反应产生。且支架存在的位置通常已被组织包裹，生长能力缓慢。支架降解留下的孔隙被组织长入的过程需要调控。

基于上述现有技术中存在的问题，如何设计生物支架材料的形式，使其可以在冰冻环境下长期保存，在保证支架结构不被破坏的前提下，还需实现减缓释放速率，使支架降解与外泌体释放的速率同步展开，对组织修复意义重大。