[发明专利]酮基化酶的突变体蛋白及应用

说明书

本发明公开一种蛋白质，为β‑胡萝卜素酮基化酶的氨基酸序列的第6位、第12位、第105位、第147位、第152位、第239位中的多种或一种氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，角黄素和/或虾青素的合成能力提高。本发明还提供所述蛋白质的相关生物材料和衍生物，及其在制备角黄素和/或虾青素中的应用。本发明蛋白质的虾青素产量及虾青素含量在类胡萝卜素中的占比均有大幅度的提升，尤其是A6T、T105A、L239M这3种氨基酸残基替换均发生的CrtW*突变体，虾青素产量及其在类胡萝卜素中的占比从β‑胡萝卜素酮基化酶的0.6±0.10mg/g cdw和17％分别提高到了3.21±0.18mg/g cdw和92％。

技术领域

本发明涉及酮基化酶的突变体蛋白及应用，属于生物技术领域。

背景技术

虾青素(3，3’-二羟基-4，4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素)是一种红色类胡萝卜素，普遍存在于海洋环境中。虾青素由海洋食物链的初级生产者微藻及浮游植物合成，一些浮游动物或甲壳类动物如鲑鱼、小虾、龙虾等自身不能合成虾青素只能通过对微藻和浮游植物的摄取，在体内积累虾青素而略带浅红色。在饲料添加剂中加入虾青素不仅能使水产生物呈现鲜艳的色泽、吸引消费者，还能为其生长繁殖提供营养，因此被广泛用于水产养殖业。虾青素是目前自然界中发现的抗氧化能力最强的天然化合物，其抗氧化活性达到β-胡萝卜素的10倍。药理学和生理学研究还发现虾青素有抗肿瘤、预防心血管疾病、增强免疫力等生物活性，因而也被广泛用于医药保健行业(Tao,L.A.,Wilczek,J.,Odom,J.M.,Cheng,Q.O.,2006.Engineering a beta-carotene ketolase for astaxanthinproduction.Metabolic engineering.8,523-531)。虾青素的出现，使得抗氧化剂市场出现了革命性的变化，它一跃成为最具潜力的新型抗氧化制剂。

天然虾青素主要发现于海洋环境中的海洋动物和微生物中。根据虾青素的来源，目前其生产方式主要有：化学合成、水产品加工、生物合成三种方法(Ausich,R.L.,1997.Commercial opportunities for carotenoid production by biotechnology.PureAppl Chem.69,2169-2173)。化学合成的虾青素产量较高，价格相对便宜，但是过程复杂，所得产品是三种立体异构体的混合物，抗氧化活性较低。同时，动物体对化学法合成的虾青素吸收能力差，并且在着色和生物效价等方面，化学合成的虾青素较天然虾青素低很多。欧盟委员会只允许天然虾青素作为食品色素，并且美国FDA禁止在食物中加入化学合成的虾青素，因此化学合成的低效产品逐渐被淘汰和禁止使用。水产品加工法主要是从虾和蟹等甲壳类水产品废弃物中提取，此类方法成本高、产品纯度低、灰分和几丁质含量高、产量低、提取后的废液对环境污染大，仅极少数国家使用。

基于虾青素的生物合成途径，已有研究利用合成生物学的方法对不能合成虾青素的大肠杆菌、蓝藻、酵母等模式生物进行遗传改造，引入一系列外源的虾青素合成基因，构建产虾青素重组菌株。Lemuth等将crt系列基因整合到大肠杆菌染色体上，通过降低crtZ的表达来协调β-胡萝卜素酮基化酶(CrtW)和羟化酶(CrtZ)的比例，减少了玉米黄素的生成，构建的E.coliBW-ASTA产量高达1.4mg/g DCW(Lemuth,K.,Steuer,K.,Albermann,C.,2011.Engineering of a plasmid-free Escherichia coli strain for improved invivo biosynthesis of astaxanthin.Microbial cell factories.10,29)。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何提高虾青素/角黄素的产量。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质是由β-胡萝卜素酮基化酶(CrtW)进行以下1)-6)中的多种或一种氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白：