[发明专利]一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明提供了一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，包括反应体系，所述反应体系包含：LongAmp Taq DNA聚合酶、5x GC buffer、dNTPs、DNA样本、水、以及一对特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。该方法具有扩增特异性强、扩增偏好性小的特点。本发明还提供了一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒的应用。采用本发明的PCR检测试剂盒可以对携带CTG重复扩张的杂合等位基因样本进行扩增，同时可以用于检测萎缩性肌强直蛋白激酶基因3’‑UTR的CTG三碱基重复次数。

技术领域

本发明属于PCR扩增技术领域，具体地说，是关于一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用。

背景技术

强直性肌营养不良1型(Myotonic Dystrophy Type 1,DM1)是一种以肌无力、肌强直、肌萎缩为特征，同时还伴有内分泌、心脏、眼部晶状体等其他系统损害的遗传性疾病。DM1是由于位于染色体19q13.2-13.3的DMPK基因3’-UTR区域CTG三碱基重复扩张所引起的，一般CTG重复次数大于50次才会致病；发病年龄和CTG重复次数呈负相关，并且不同的CTG重复次数其主要并发症及其严重程度有所不同。随着该致病基因的遗传，一般情况下，下一代的DMPK基因中CTG重复次数要比上一代多一些，目前已知的DMPK基因中CTG重复次数从5次到5000次不等。

患者DMPK基因中CTG重复次数的测定，结合临床病理表现，有助于医生了解基因型与病理表现的关系。目前，相关报道的检测方法主要包括非扩增的Southern-blot和基于扩增的PCR方法。由于不涉及DNA扩增，Southern-blot需要的样本量较大，另外其耗时较长、成本较高，应用于临床检测较为困难。而用于DMPK基因中CTG重复次数的测定的PCR扩增方法众多，主要包括普通PCR、三重引物PCR(TP-PCR)、热脉冲PCR(HPE-PCR)、Small-pool-PCR(SP-PCR)以及Flash-small-pool PCR(FSP-PCR)。

基于PCR扩增的DMPK基因CTG重复次数测定方法，相对非扩增的southern-blot和三代测序来说，具有样本用量少、耗时短、成本可控等优点。但同时也存在偏好性扩增的问题，就是在绝大部分情况下DM1患者的DMPK两个等位基因中CTG重复次数为一大一小，而PCR技术更倾向于扩增小片段，导致大片段的检测困难。目前比较成熟的技术TP-PCR，虽然比较稳定、可重复性好。但是，其只能检测出240次以内的CTG重复次数明确值，对于重复次数较大的情况(240次重复)还不能准确的给出重复次数(如中国专利文献201410211499.0公开的一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒)。另外，TP-PCR方法中需要用到的部分引物需要荧光基团修饰，相对成本较高。

而HPE-PCR、SP-PCR以及FSP-PCR，虽然可以扩增带有较大CTG重复的DMPK基因片段，但是耗时较普通PCR长，且稳定性不好。如HPE-PCR在PCR程序的延伸阶段，不是一个恒定的温度，而是一个70-83℃的循环脉冲波，该程序的设置对仪器提出了一定的要求，只有具有设置嵌套循环等的PCR仪才能满足要求。持续快速的热脉冲对仪器的损耗较大，并且该程序有较长时间处于70-83℃之间，对DNA聚合酶的热稳定性也提出了较高的要求。SP-PCR以及FSP-PCR，操作繁杂，不适合常规诊断的应用。

发明内容