[发明专利]基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库及其构建方法

说明书

本发明提供基于鲨鱼抗体可变区V‑NAR噬菌体的合成肽库及其构建方法，设计V‑NAR框架序列，包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列，利用重叠延伸PCR获得上述完整的V‑NAR基因片段，并将其克隆至噬菌粒载体，转化至大肠杆菌，构建合成噬菌体文库。本发明提供一种新型V‑NAR框架序列，可作为鲨鱼V‑NAR抗体库的通用骨架，为抗体库的构建提供新的理论基础；利用构建的噬菌体库所筛选的Anti‑PD‑L1纳米抗体，具有潜在应用价值，可为新型抗肿瘤药物研发与获得提供新品种；所构建的基于鲨鱼抗体IgNAR的V‑NAR噬菌体库，可作为不同抗原的筛选平台，具有极高的生物医学应用价值。

技术领域

本发明涉及生物医学与分子生物学领域，尤其涉及基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库及其构建方法。

背景技术

鲨鱼体内存在一类只含重链的抗体IgNAR，其可变区V-NAR是目前已知分子量最小的抗体片段，被称为纳米抗体。V-NAR具有亲和力高、稳定性强、可溶性好、易偶联改造和良好的组织渗透能力等优势，因而在生物医药行业具有广阔的应用前景。

噬菌体展示库是目前构建文库广泛应用的方法。虽然免疫文库的抗体靶特异性较高，但是其存在局限性。例如，不仅免疫时间过长，只针对单一的免疫抗原，而且对抗原的要求也苛刻。天然文库的多样性较为丰富，但其文库的抗体结合力较弱。然而，合成抗体库具有库容大、多样性丰富、可用于筛选多种抗原以及生产成本低等优势，是目前高亲和力抗体获得的主要来源，对于V-NAR类药物的研发有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法，可作为鲨鱼V-NAR抗体库的通用骨架，为抗体库的构建提供新的理论基础。

本发明的第二个目的在于，提供一种利用本发明构建方法构建获得的基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库。

为了实现上述目的，本发明提供了基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法，设计V-NAR框架序列，包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列，利用重叠延伸PCR获得完整的V-NAR基因片段，并将其克隆至噬菌粒载体，转化至大肠杆菌，构建合成噬菌体文库；

所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区，所述CDR1区的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，所述HV2区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述HV4区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

作为一个优选方案，利用NNK突变的方法设计不同长度的CDR3，从而使CDR3区序列多样化。比如设计3种不同长度的CDR3序列,分别为13、18和22个氨基酸；同时利用NNK随机突变的方法，(N代表4种碱基，A、T、C和G，K代表2种碱基，T和G)对序列随机化，减少终止子产生，增加文库序列的多样性和有效性。

为实现上述的第二个目的，本发明提供了利用上述构建方法构建获得的基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020350。

在本发明的优选实施例中，利用固相筛选法从合成的噬菌体库中获得PD-L1特异性纳米抗体，筛选获得5株抗PD-L1纳米抗体，其均与PD-L1特异性结合，可阻断PD-1与PD-L1的结合，并具有优良的稳定性，所述抗体的序列包括FR区、CDR区以及HV区；

所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；

所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8——SEQID NO.12任一所示的CDR3区；