[发明专利]一种对淋球菌耐药基因进行多重快速测序的方法

说明书

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种对细菌的耐药基因进行多重测序的方法，特别涉及一种使用纳米孔测序技术对淋病奈瑟菌的耐药基因进行快速测序的方法。同时，本发明还涉及一种检测淋球菌耐药基因的试剂盒，该试剂盒中包含SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.28的多核苷酸。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种对细菌的耐药基因进行多重测序的方法，特别涉及一种使用纳米孔测序技术对淋病奈瑟菌的耐药基因进行快速测序的方法。

背景技术

在世界范围内，淋病仍然是最重要、最常见的性传播疾病之一，据世界卫生组织统计，2016年全球淋病新发病例高达8700万。近十几年，随着社会经济的发展，淋病在中国的发病率逐年上升，而我国人群密度大、人口流动性大的特点也为淋病的传播创造了有利条件。淋病的蔓延态势给社会造成了严重的公共卫生负担。淋病因淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，亦称淋球菌，gonococcus) 的感染引起，合理、规范的抗菌治疗是治愈疾病，遏制其传播最为有效的手段。然而，随着淋球菌对传统抗生素的耐药性不断提高，以及对三代头孢菌素的敏感性逐步降低，淋球菌有逐渐发展成为无药可用的超级细菌的趋势。淋球菌耐药目前已经成为一个严重的公共卫生问题，淋球菌也被世界卫生组织列为重点关注的十二种耐药细菌之一。

为应对这一问题，需要根据淋球菌的耐药表型，选择敏感的抗生素进行治疗，从而减缓其耐药变异的进展速度。传统上鉴定细菌的耐药表型需要分离患者样本中的病原菌进行药敏试验，该操作过程繁琐，周期较长，灵敏度低，难以为治疗提供及时准确的信息。与之相比，通过分子生物学技术，分析细菌耐药的基因型，从而预测其耐药表型，可以很好地解决上述问题，是当前的研究热点。然而不同于其他细菌，淋球菌的耐药机制十分复杂，其耐药相关位点分布在十余个耐药基因中，并且呈现为单核苷酸多态性(SNP)、马赛克样变异、质粒获得等多种形式。

PCR-Sanger测序是测序这些耐药基因，鉴定耐药位点最主要使用的方法，该方法虽然有较高的精度，但其中一个局限在于反应重数低，单次反应只能够扩增并分析一个基因，并且测序反应之后还需要手工对序列进行校对和截取。由于淋球菌的耐药性涉及到十余个基因，对其进行全面鉴定无疑需要大量的重复工作，这使得整个鉴定流程十分繁琐、费时费力。另外一个重要的局限在于，该方法的应用以分离到淋球菌菌株为前提，而在部分淋病患者中，感染的细菌载量较低，不能分离到菌株，从而导致该方法的使用受到很大的限制。

为了弥补这些缺陷，一些较新的分子生物学技术，例如荧光定量PCR高分辨率熔解曲线分析、MassARRAY核酸质谱等，被应用于解决这一问题，这些技术虽然能够同时进行多位点的分析，但受限于技术本身的特点，其结果只能间接提示一部分表现为SNP的耐药位点存在与否，无法获得耐药基因的完整序列。单纯应用这些技术，会遗漏重要的序列信息，同时也无法探索未知或者新型变异。

由Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司推出的MinION纳米孔测序仪是第三代测序仪中的代表，相对于二代测序仪，MinION测序仪具有长读长、便携和实时产出数据的特点。目前，将MinION测序仪应用于传染病病原体鉴定和耐药特征分析是领域内的研究热点，但是现有建立的方法均是基于宏基因组学的思想，即对由样本提取的核酸进行无偏测序。在临床样本中，宿主的核酸占据绝对优势，因此在测序结果中只能筛选到极少量的病原体及耐药基因相关序列，很难覆盖到全部的耐药基因及分子分型基因；同时，MinION测序仪的准确度较低，若要达到单碱基水平的分析精度，还需要大幅增加覆盖度。考虑到这两点要求，仅使用基于宏基因组学策略的测序方法是不能够满足的。