[发明专利]一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法

权利要求书

1.一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，采用高温热分解法合成稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒；

S2，采用液相包覆沉积法对上转换荧光纳米颗粒表面进行氨基修饰，使上转换荧光纳米颗粒具有水溶性；

S3，采用水热法合成具有氨基基团的四氧化三铁纳米颗粒；

S4，合成目标菌体的适配体以及与该目标菌体的适配体碱基互补配对的cDNA核酸单链；

S5，采用戊二醛交联法完成cDNA核酸单链在水溶性上转换荧光纳米颗粒表面的再修饰，得到上转换荧光探针；

S6，采用戊二醛交联法完成目标菌体的适配体单链在氨基化四氧化三铁纳米颗粒的表面修饰，得到磁性纳米材料捕捉探针；

S7，将S5制得的上转换荧光探针和S6制得的磁性纳米材料捕捉探针混合，并在37℃下孵育连接，得到检测探针，用荧光光谱仪测得980nm激发波长时548nm波长的荧光值；

S8，制备不同浓度梯度的菌液，用S7制得的检测探针对菌液进行检测，测得复合物荧光强度减弱值并绘制标准曲线；

S9，制备待测样品的检测体系，测得加入待测样品后的荧光值，得到待测样品中的实际目标细菌的数量。

2.根据权利要求1所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒为掺杂镧系Er金属的上转换荧光纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒是采用高温热分解法合成，具体操作为：将稀土激活剂和敏化剂的氯化物、NaOH、NH₄F、YCl₃加入到有机溶剂中，经过不同阶段的温度反应，迅速升温至300℃，加热1小时，经乙醇洗涤后获得稀土元素掺杂的上转换荧光纳米材料。

4.根据权利要求1所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米颗粒具有氨基基团，四氧化三铁纳米颗粒水溶性良好，分散性良好，颗粒大小均匀，且可在30s内经磁铁快速分离。

5.根据权利要求4所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米颗粒采用水热法合成，具体操作为：将1,6-乙二胺、六水合三氯化铁、无水醋酸钠加入到乙二醇中，升温至50℃，待溶液变为酒红色，将溶液转移至高压反应釜，置于180℃的烘箱中反应6h，制得四氧化三铁纳米颗粒。

6.根据权利要求1所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，S8中制备已知浓度的检测体系，得到不同梯度的菌液的具体操作是：取目标菌液接种于300mL牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃恒温培养30小时后进行平板计数，求出每毫升蜡样芽孢杆菌的数目，加入PBS缓冲液稀释不同浓度梯度的菌悬液，取样加入至上转换荧光检测体系中，用于检测。

7.根据权利要求6所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，S8中绘制标准曲线的具体操作是：分别将不同浓度的菌液与所制备的检测探针混合并经过一定时间的孵育，置于石英比色皿中，通过荧光光谱仪测得经激发波长为980nm的激发光照射后在548nm处产生的荧光值，绘制得到标准曲线。

8.根据权利要求6所述的一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于，S9中制备待测样品的检测体系的具体操作是：取细菌样品加入到稀释处理的牛奶样品中混匀，取牛奶样品加入检测体系进行检测，经磁分离洗涤后，根据底部复合物的荧光值，将目标细菌浓度对数值代入对应的荧光值标准曲线，即求得样品中目标细菌的数量。