[发明专利]一种巢式等温扩增结合基因编辑检测COVID-19病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

(1)巢式恒温扩增体系：RAA重组酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液、无核酸水和巢式RAA扩增结合COVID-19病毒引物组。

(2)基于基因编辑的核酸检测体系：Cas13a核酸酶、导向RNA、非特异性报告分子、检测缓冲液C。

(3)可视化检测系统：横向流动试纸条、检测层析液。

2.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述巢式恒温扩增体系的RAA重组酶被制作成干粉并分装到八连管中。

3.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述RAA重组酶包括细菌重组酶UvsX、辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和dNTPs。

4.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述巢式恒温扩增体系的反应缓冲液V包括30-50mM的Tris PH7.9、50-70mM的醋酸钾、5-10mM的乙酸镁、0.6-1.2mM的DTT、1.8-2.9mM的ATP、10-18mM的磷酸肌酸、60-90ng/ul的肌酸激酶和质量浓度为4-6％的聚乙二醇。

5.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述醋酸镁溶液的摩尔浓度为100-300mM。

6.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述Cas13a核酸酶选择细菌蛋白表达系统进行纯化。

7.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述导向RNA包含Cas13a核酸酶识别序列和靶向病毒RNA的互补序列。

8.根据权利要求7所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述导向RNA序列为：

(1)5-‘GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACAGGGTCCACCAAACGTAATGCGGGGTGC-3’

(2)5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTAGCAGGATTGCGGGTGCCAATGTGATC-3’。

9.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述非特异性报告分子序列为：

/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/，其中5’端用FAM标记，3’端用生物素标记。

10.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述检测缓冲液C包含1-3U T7 DNA聚合酶、8-12mM rNTPs和2-4mM的氯化镁。

11.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述横向流动试纸条的前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有固定抗体。

12.根据权利要求1所述的一种巢式等温扩增结合基因编辑COVID-19病毒试剂盒，其特征在于：所述检测层析液为无核酸的纯净水。