[发明专利]一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法

权利要求书

1.一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取冷冻复苏的鸡胚细胞，在鸡胚细胞中加入15-20倍体积的牛血清中，离心，倒掉上清液；

S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.1-0.3V，电流为1-2mA；

S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养24-36小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；

S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将培养瓶放置于3-5％CO₂培养箱中，在低转速下吸附0.5-1h，补加牛血清，在补加牛血清之后，在培养瓶中加入培养液10-20%体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.3-0.5g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.5-0.8g/L，得到混合培养液，并放回到3-5％CO₂培养箱中，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射，并在搅拌状态下进行继续培养，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.5-1.0V，电流为3-5mA；所述鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.01MOI-0.1MOI；

S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID₅₀，在病毒TCID₅₀达到最高时收获病毒并保存。

2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S2中鸡胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃；培养转速为100-120r/min。

3.根据权利要求2所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S1中离心的速率为3000-5000r/min，离心时间10-20min。

4.根据权利要求3所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S2中悬浮培养中，每间隔6-8小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积10-15%的牛血清。

5.根据权利要求4所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S4中，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的1-2倍，所述培养箱的温度为35-37℃。