[发明专利]预示荷斯坦奶牛乳房炎乳源外泌体miRNA诊断标志物

说明书

本发明公开了一种预示荷斯坦奶牛乳房炎乳源外泌体miRNA诊断标志物，是以乳源外泌体miR‑223和miR‑200b做为荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物；成功分离和鉴定荷斯坦奶牛乳源外泌体；荷斯坦奶牛乳房炎个体外泌体中miR‑223的水平较对照组显著增加(P＜0.001)；miR‑200b的水平较对照组显著降低(P＜0.001)。由于在外泌体的提取过程中，绝大部分蛋白成分被去除，泌体miRNA较牛奶miRNA可以更为准确地反映奶牛个体是否患乳房炎。

技术领域

本发明涉及一种预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，进一步讲是提供了以乳源外泌体miR-223/miR-200b作为诊断标志物对荷斯坦奶牛乳房炎进行早期诊断，属于奶牛疾病生物诊断技术领域。

背景技术

奶牛乳房炎是世界公认的奶牛三大疾病之一，导致奶牛暂时或永久性降低产奶量和牛奶品质、延长产后发情周期、失去繁殖性能等。长期以来，奶牛乳房炎对奶牛养殖业造成的经济损失位居各类疾病之首，是乳制品行业中高成本的疾病。

据报道全球存栏的2.2 亿头奶牛约有三分之一患有乳房炎及隐形乳房炎，发病率很高且不同国家和地区奶牛乳房炎的发病率存在一定差异。乳房炎是乳房组织的炎症，可由各种感染因子引起，通常是由金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和大肠杆菌等病原体引起的微生物感染的结果，是一种以临床表现为乳房局部变化和乳汁分泌异常的慢性或急性疾病，它的特点是体细胞数量升高，通常伴有牛奶的物理、化学或微生物的变化。

随着生物进化过程，原核生物和真核生物均已进化出简洁而高效的细胞间通讯策略。经典的细胞生物学认为，细胞间通讯有二种方式，通过直接接触相互作用或者分泌可溶性因子如激素、生长因子、细胞因子等间接作用。近几年的研究发现，外泌体作为第三种新发现的重要的细胞间通讯载体，能够介导细胞之间蛋白质、脂质和核酸等生物大分子的转运，广泛影响机体的生理病理过程。外泌体是指不同类型细胞分泌的由磷脂双分子层膜包裹蛋白质、脂质和核酸形成的囊泡结构，能够在细胞间转运蛋白质、脂质和核酸，是介导细胞间通讯的有力载体。miRNA存在于各种体液中，并选择性地包装在外泌体内，这是一种由大多数细胞类型分泌的膜囊泡。这些外泌体miRNA可以被主动递送到受体细胞中，并且可以调节靶基因表达和受体细胞功能。外泌体天然存在于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液和乳汁，为其广泛调控机体生理病理过程提供了基础。

发明内容

本发明公开一种作为预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，是以乳源外泌体miR-223和miR-200b做为诊断标志物对荷斯坦奶牛乳房炎进行早期诊断，解决了现有技术中对荷斯坦奶牛乳房炎检测的不足。

本发明公开的一种预示荷斯坦奶牛乳房炎的诊断标志物，其特征在于所述的诊断标志物为：乳源外泌体miR-223和miR-200b；其中，

miR-223诊断标记序列如SEQ no.1所示；

miR-200b诊断标记序列如SEQ no.2所示。

本发明所述的一种以乳源外泌体miR-223和miR-200b做为诊断标志物预示荷斯坦奶牛乳房炎的早期诊断方法，包括以下步骤：

1、将奶样分梯度低速离心进行：

300×g/min、10 min；3000×g/min、20 min；10000×g/min、30 min离心收取上清；

再行梯度超速离心30000×g/min、60 min；50000×g/min、90min；70000×g/min、90 min；95000×g/min 60 min；120000×g/min 、90min；120000×g/min、90 min；