[发明专利]用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。本发明的新型组合培养基是将人羊膜进行液氮研磨、超声匀浆、梯度离心、过滤除菌得到含羊膜提取物的培养基，含羊膜提取物新型组合培养基能有效保护胰岛体外存活及功能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种由于自身胰岛细胞破坏导致胰岛素生成不足或受体细胞对胰岛素产生抵抗而使胰岛素的代谢产生缺陷的葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。自Edmonton Protocol发布以来，胰岛移植由于其相对于成体器官移植来说创伤小、又能取得可靠的移植效果而被视为治疗1型糖尿病和部分2型糖尿病的有效方法之一。

目前，在临床胰岛移植中为了胰岛的进一步纯化、胰岛质量的检测、胰岛的运输转移以及受体的免疫诱导，胰岛从被实验员在供体胰腺中提取出来到被外科医师移植到受体前需要在体外培养24-72小时，大多数移植中心采取的培养时间为48小时。在这段体外培养时间内，有超过20％的胰岛丢失。研究表明，胰岛在体外培养中主要的丢失原因为无血清引发的炎症反应。目前临床上用于体外胰岛培养的培养基为CMRL1066+0.625％HSA,0.625％HSA为胰岛的存活提供一定的渗透压，但缺少血清中的各种有利于胰岛细胞存活的细胞因子。

基础研究表明CMRL1066+10％FBS更适用于体外胰岛培养，但是由于动物源性而不被临床采用。人血清中含有细胞因子，但是同时存在和胰岛细胞发生免疫反应的细胞因子，容易导致胰岛细胞损坏。因此，亟需研究一种新的人胰岛体外培养组合培养基。

发明内容

为此，本发明提供用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种用于胰岛培养的组合培养基，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。

本发明的一个实施例中，所述BSA的质量百分数为0.625％。

本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物蛋白的质量浓度为0.1-1.0mg/mL。

本发明还提供一种制备所述的用于胰岛培养的组合培养基的方法，其包括：向所述CMRL1066培养基中添加BSA和羊膜提取物，混合均匀，得到所述组合培养基。

本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物的添加方法为：

用含青霉素和链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜颗粒，将所述羊膜颗粒加入到CMRL1066基础培养基中，4℃超声匀浆，将超声匀浆物离心，取上清液，将所述上清液过滤后，得到滤液，再向所述滤液中添加BSA后，得到所述组合培养基。

本发明的一个实施例中，所述羊膜颗粒与所述CMRL1066培养基的质量体积比为1:2。

本发明的一个实施例中，所述超声匀浆过程中，匀浆机转速为10000rpm，超声匀浆温度为4℃，超声匀浆时间为1h。

本发明的一个实施例中，所述离心为梯度离心，先4000g离心10min后，提取上清液，将所述上清液再15000g离心5min后，再提取上清液，离心温度为4℃。

本发明的一个实施例中，所述青霉素的浓度为1000IU/ml，所述链霉素的浓度为0.1mg/ml。