[发明专利]高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种高产L‑氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌是通过弱化原始菌株中基因NCgl2493和/或NCgl0224，获得的基因弱化菌株；其中，原始菌株为产L‑氨基酸的棒状细菌。本发明提供的高产L‑氨基酸的工程菌，具有较高的L‑氨基酸(特别是L‑赖氨酸)生产能力，且棒状细菌胞内的NCgl2493基因和/或NCgl0224基因表达蛋白失活或弱化。实验表明，以本发明的高产L‑氨基酸的工程菌作为发酵菌种，其L‑赖氨酸产率和转化率显著提高，为L‑赖氨酸的工业化生产奠定了基础，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-氨基酸，特别是L-赖氨酸，L-苏氨酸等，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中L-赖氨酸约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。L-苏氨酸广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等，是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。

微生物发酵法生产L-氨基酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-氨基酸最主要的方法。近年来代谢工程改造已很大程度上提高了菌株性能，但依然有潜力继续提高产量和转化率。棒杆菌属细菌，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是“一般认为安全”(GRAS,generally recognized assafe)菌株，被广泛用于L-氨基酸生产，特别是L-赖氨酸的生产。相比大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌的赖氨酸合成路径具有明显优势，其合成赖氨酸前体α,ε-二氨基庚二酸仅需通过一步酶催化反应，即二氨基庚二酸脱氢酶催化完成，而大肠杆菌则需四步酶催化反应。所以，利用谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸具有明显的优势。

谷氨酸棒杆菌同样可以用来生产L-苏氨酸，且比大肠杆菌具有代谢途径上的优势。其缘由为，谷氨酸棒杆菌具有丙酮酸羧化酶，可以充分利用丙酮酸前体来合成L-苏氨酸。而大肠杆菌中不存在该酶，糖酵解途径产生的多余的丙酮酸只能进入TCA循环，不能用于合成L-苏氨酸，降低了糖酸转化率。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。

本发明的另一目的是提供发酵生产L-氨基酸的方法或提高L-氨基酸发酵产量的方法。

本发明构思如下：发明人经过长期研究和实践，偶然发现在棒杆菌的染色体中两个编码“假定蛋白”(通过生物信息学方法注释)的基因的改造可有助于提高L-氨基酸的产量，特别是提高L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-天冬氨酸的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供NCBI参考序列NCgl2493和/或NCgl0224的活性和/或表达量降低或消失在棒状细菌发酵生产L-氨基酸中的应用。

第二方面，本发明提供发酵生产L-氨基酸的方法或提高L-氨基酸发酵产量的方法，包括：

(1)改造棒状细菌染色体上编码NCBI参考序列NCgl2493和/或NCgl0224的基因，使NCgl2493和/或NCgl0224的活性和/或表达量降低或消失；

(2)用步骤(1)改造得到的细菌发酵生产L-氨基酸。

进一步地，步骤(1)中所述改造包括使棒状细菌染色体上编码NCBI参考序列NCgl2493和/或NCgl0224的基因发生一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或增加。

进一步地，步骤(1)中所述改造包括对棒状细菌染色体上编码NCBI参考序列NCgl2493和/或NCgl0224的基因进行敲除。