[发明专利]冰冻植物组织Hi-C建库的方法

说明书

本发明公开了一种冰冻植物组织Hi‑C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，冰冻植物组织液氮研磨；S2，加入甲醛进行固定，加入甘氨酸进行终止固定；S3，过细胞筛网；S4，将固定化的细胞进行细胞裂解，然后进行限制性内切酶消化；S5，进行标记物标记，并平末端化；S6，重新连接；S7，解除固定化，进行DNA片段的提取，回收DNA片段；S8，去除带有标记物标记但未连接的DNA片段；S9，DNA打断；S10，钓取含有标记物标记的DNA片段；S11，末端修复加接头；S12，PCR扩增，获得Hi‑C文库。应用本发明的建库的方法，利用冰冻植物组织进行Hi‑C建库，可以达到与新鲜叶片Hi‑C建库同等的有效数据率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。

背景技术

DNA是细胞遗传信息的载体，在生物体内以染色质的形式存在于每个细胞中，并控制着整个生命活动的进程。目前绝大多数对于DNA信息的研究是以研究DNA分子内碱基的序列(DNA的一维信息)来进行，通过分析碱基排列信息来探究生命活动的规律。

真实状态中的细胞核是一个狭小的三维立体空间，直链分子结构的DNA会以复杂的卷曲方式位于细胞核内，原一维DNA序列被赋予三维空间构象，并导致了大量复杂的基因调控作用方式。对此，简单的一维DNA序列信息由于不能提供真实DNA空间分布相关的信息，因此也无法解释由于空间构象导致的一系列基因调控现象。为解决这一问题，目前已有一系列的检测方法。如3c(染色体结构捕获)方法及衍生的4c、5c方法。这些方法均以测序为基本检测手段，利用细胞核内蛋白形成DNA结构固定因子，之后通过对DNA的片段重联等构建带有空间结构信息的DNA序列，最后使用测序技术来检测染色质DNA信息，并计算其在空间中分布和相互作用。尽管此类方法在一定程度上能够提供部分染色质相互作用信息。但由于其方法与技术限制，这一类的方法仅能检测定点或部分的DNA相互作用位点，无法探究全细胞核水平上的立体互作信息。因此不可避免地大量信息将会遗漏。在对于未知相互作用信息的发现上，这一点尤为重要。

近年来随着高通量测序技术的出现，大规模基因组信息的获得变得更加容易。Hi-C技术便是结合高通量测序的方法，对整个细胞核内染色质的信息进行检测的技术。Hi-C技术是染色体构象捕获(Chromosome conformation capture，简称为3C)的一种衍生技术，是指基于高通量进行染色体构象的捕获，它能够在全基因组范围内捕捉不同基因座位之间的空间交互，研究三维空间中调控基因的DNA元件。

比如Genome-wide analysis of local chromatin packing in Arabidopsisthaliana(2015)报道了一种拟南芥新鲜幼苗的Hi-C建库方法，该方法利用甲醛固定染色质结构，然后通过限制性内切酶打断原基因组序列，并进行生物素标记后，再重新连接形成带有结构信息的新DNA分子。在这一过程中，如果两个不同基因组位置的DNA分子片段连接形成一个杂合分子，这将被认为是这两个DNA分子在空间上相互临近的证据。然后对DNA进行纯化并打碎，再针对标记的生物素分子进行钓取，富集获得所需的空间上相互作用的DNA杂合分子。最后构建高通量测序的文库及双端测序检测，获得全染色质在空间上的相互作用信息。

但是，采用该文献报道的方法构建的冰冻植物叶片Hi-C，最终建库失败。另外，现有的新鲜植物叶片固定步骤，对于冰冻植物叶片不适用，固定效果差，样品易降解，最终导致建库失败。

发明内容

本发明旨在提供一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法，以解决现有技术中冰冻植物叶片Hi-C建库失败的技术问题。