[发明专利]一种撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法及应用

权利要求书

1.一种撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，

斜面种子培养，在无菌条件下将菌株涂布接种于斜面培养基上，得斜面菌丝，培养温度为22-30℃，培养时间为7-10天，菌株的保藏编号为CGMCCNo.10485；

摇瓶种子培养，在无菌条件下，挖取生长成熟的斜面菌丝，接种于摇瓶培养基中，再置于恒温培养振荡器上，得摇瓶种子液，振荡频率为200-260rpm，培养温度为22-30℃，培养时间为48-90小时；

种子罐培养，将摇瓶种子液种入种子罐培养基中，得种子罐种子液，振荡频率为120-200rpm，空气流量为1：0.8-2.0vvm，罐压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为60-90小时；

发酵罐培养，将种子罐种子液压入发酵罐培养基中，得发酵罐菌丝体，振荡频率为60-140rpm，空气流量为1:0.2-0.8vvm，罐压0.05MPa，培养温度为22-30℃，培养时间为110-170小时；

发酵液预处理，待发酵罐菌丝体发酵完毕后，加入助滤剂珍珠岩，搅拌均匀后得到预处理发酵液；

固态菌丝体的制备，将预处理发酵液送入板框压滤器过滤，弃滤液，所得滤饼再进行压缩空气干燥脱水，得到固态菌丝体；

稀释菌丝体，按菌丝体的重量加入2.0～2.5倍的孢子保护剂，搅拌混匀后即得pH值为5.8-6.2的菌丝体稀释液；

稀释菌丝体步骤中，需要先制备孢子保护剂，步骤如下：

将18kg氯化钠、16.68kg磷酸二氢钾、1.74kg磷酸氢二钾置于容积为2000L的配液罐中，加入适量饮用水，搅拌混合均匀后制得孢子保护剂；

密闭封存，将菌丝体稀释液进行分装密封存放4个月以上后得到撕裂蜡孔菌高浓度孢子液。

2.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，斜面种子培养步骤中，斜面培养基通过以下步骤制得：

将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；

将20g葡萄糖和20g琼脂粉同时溶于上述滤液中加热搅拌；

待琼脂粉充分膨化溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；

将定容后的1000ml溶液分装于若干支试管中，每支试管装量10ml-15ml，塞住各个试管的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后，得到所述斜面培养基。

3.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，摇瓶种子培养步骤中，摇瓶培养基通过以下步骤制得：

将200g马铃薯洗净切片后用水煮沸30分钟，过滤后取滤液待用；

将20g葡萄糖溶于上述滤液中加热搅拌；

待葡萄糖溶解后再用水定容至1000ml，自然pH；

将定容后的1000ml溶液分装于若干三角瓶中，每瓶装量100-150ml，塞住各个三角瓶的开口后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述摇瓶培养基。

4.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，种子罐培养步骤中，种子罐培养基通过以下步骤制得：

将6kg葡萄糖、12kg马铃薯、9kg黄豆粉和100L水置于种子罐中，搅拌至物料充分混匀后用水定容至250L；

加入0.12L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后得到所述种子罐培养基。

5.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，发酵罐培养步骤中，发酵罐培养基通过以下步骤制得：

将240kg葡萄糖、180kg黄豆粉、1.5kg磷酸氢二钾、7.2kg磷酸二氢钾、3.0kg硫酸镁、0.012kg生物素、0.012kg泛酸钙、0.024kg氯化钴置于配料池中，加入适量水搅拌均匀；

将上述混合均匀的物料送入发酵罐中，同时投入240kg马铃薯至发酵罐中，用水定容至10500L，自然pH；

加入3.6L泡敌后密封灌口，然后进行灭菌处理，灭菌完毕后制得发酵罐培养基。

6.根据权利要求1所述的撕裂蜡孔菌高浓度孢子液的制备方法，其特征在于，密闭封存步骤中，将获得的预处理发酵液分装后，放入密闭阴凉处存放，存放4个月后开始取样计数，采用血球计数板进行计数，计数时，每个样品重复计数2-3次；计数合格后即得撕裂蜡孔菌高浓度孢子液。