[发明专利]一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株；

通过构建丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的表达载体，并将所述表达载体导入到野生型出发菌株丙丁梭菌（Clostridium acetobutylicum）以获得所述的重组丙丁梭菌；

所述的木糖内酯酶核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

2. 根据权利要求1所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为Clostridium acetobutylicum TXYL，于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2020107。

3.一种如权利要求1所述的重组丙丁梭菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）通过酶切连接方法，将如SEQ ID NO:3所示的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列、如SEQ ID NO:2所示的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列和如SEQ ID NO:1所示的木糖内酯酶核苷酸序列连接入载体质粒pIMP1中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的5’端均连接有如SEQ ID NO:4所示的丙丁梭菌启动子，获得重组质粒pIMP1-XylTBC；

2）将步骤1）中获得的重组质粒pIMP1-XylTBC转入E. coli DH10B中，得到甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC；

3）将步骤2）中经甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC转化至野生型出发菌株丙丁梭菌（Clostridium acetobutylicum），经培养、筛选获得丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的重组丙丁梭菌。

4.一种厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的方法基于权利要求1或2所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌或如权利要求3所述的方法制备的重组丙丁梭菌，其特征在于，包括以下步骤：

1）重组丙丁梭菌活化培养：将重组丙丁梭菌接种至液体活化培养基中，置于厌氧环境中静置培养，培养温度为37℃，静置活化培养16~24 h用于种子培养；

2）重组丙丁梭菌种子培养：将步骤1）中活化的菌种按10％(v/v)接种量接种于液体种子培养基中，置于厌氧环境中摇瓶培养，培养温度为37℃，转速为130~200 rpm，培养18~24h用于厌氧发酵培养；

3）重组丙丁梭菌发酵培养：采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵温度控制在33～39℃，搅拌转速为130~200 rpm，接种前发酵罐通入N₂以除去发酵培养基中的溶氧，发酵24~72 h。

5.根据权利要求4所述的生产丁醇的方法，其特征在于，在步骤3）中，通过添加稀硫酸或氢氧化钾溶液将接种后发酵培养基初始pH调至5.5；或者，接种后，添加碳酸钙以控制发酵全程在pH5~6范围内。

6.根据权利要求4所述的生产丁醇的方法，其特征在于，

在步骤3）中，所述的发酵培养基为秸秆水解液发酵培养基，所述的秸秆水解液发酵培养基为秸秆经过物理、化学、生物或联合预处理及纤维素酶酶解后获得的水解液，所述的水解液主要包含葡萄糖20~60 g/L，木糖10~30 g/L。

7.根据权利要求4所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述的秸秆选自玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆及稻草秸秆中的一种或几种，所述的秸秆预处理前粉粹至0.1~0.5 mm。

8.权利要求1或2所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌或如权利要求3所述的方法制备的重组丙丁梭菌用于厌氧发酵生产丁醇的应用。