[发明专利]一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法

权利要求书

1.一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取鲜活牡蛎，撬开牡蛎，用灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，取牡蛎组织按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿，研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物，按1g:2~4 mL比例往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水，震荡混匀，在10000 g，离心5~15 min，取上清液，将上清液过滤，收集噬菌体初级滤液；

（2）使用LB或2216E培养基培养弧菌，将弧菌菌液加至步骤（1）的噬菌体初级滤液，弧菌菌液的加入量为噬菌体初级滤液体积的1%，得到混合液，然后加入10×LB培养基或10×2216E培养基，混合液与10×LB培养基或10×2216E培养基的体积比为9:1，在30℃、200 rpm摇床培养3~48 h，于12000 g、离心5~10 min，取上清液，将上清液过滤，取滤液，然后进行10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8梯度稀释，得到各级稀释滤液；

（3）使用LB或2216E培养基培养弧菌，培养至OD_600nm为0.6~1.0，得到宿主菌；分别将步骤（2）的各级稀释滤液与宿主菌按体积比为10:1混合，得到混合液；将混合液加至45℃含0.7wt%琼脂的LB或2216E培养基中，混合液与含琼脂的LB或2216E培养基的体积比为0.11:5，迅速混匀，立即倾倒在含1.5 wt%琼脂的LB或2216E固体培养基上，待冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；

（4）取噬菌斑数量为50~500PFU的双层平板，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL LB或2216E培养基，旋涡振荡，再做10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释，按照步骤（3）和（4）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑；

（5） 取纯化后的噬菌斑，经磨碎后，加入LB或2216E培养基和弧菌菌液培养至透明裂解，离心，取上清液，将上清液过滤，收集过滤液，即得到弧菌噬菌体。

2.根据权利要求1所述的利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的LB或2216E培养基和弧菌菌液的体积比为100:1；所述的离心是在12000 g、离心10 min。

3.根据权利要求1所述的利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）、（5）中的过滤是用0.45 μm一次性过滤器过滤。