[发明专利]槟榔黄化植原体微滴式数字PCR检测试剂盒、方法及应用

说明书

本发明基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。引物Atf/Atr和探针AtProbe可特异性地在槟榔黄化病发病组织中检测到植原体信号，每个反应微滴生成数大于10000，绝对定量结果可信。基于建立的槟榔黄化植原体ddPCR技术检测分析表明：在海南定安、三亚、屯昌、文昌、万宁等不同市县槟榔黄化病样品中均检测到植原体，植原体浓度最低为0.07copies/μL，与LAMP检测技术相比灵敏灵提高约1000倍；本发明建立的ddPCR检测技术对于槟榔黄化植原体定量检测、病害流行监测、传播媒介昆虫和中间寄主筛选、槟榔种苗检疫及槟榔黄化病综合防治等研究具有较为重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种微滴式数字PCR检测试剂盒，具体涉及一种基于植原体tuf基因序列设计特异性引物Atf/Atr和探针AtProbe，建立槟榔黄化植原体ddPCR检测技术，并采用建立的ddPCR技术对采自我国海南省不同地区槟榔黄化病样品及发病组织不同部位进行检测分析。

背景技术

植原体是一类寄生于植物韧皮部、尚不能分离纯化的原核致病菌(Doi et al,1967)。槟榔(Areca cathecu L.)是一种棕榈科常绿乔木，我国重要的南药资源之一，具有很高的药用价值和经济价值。

由植原体引起的槟榔黄化病是是我国海南槟榔生产上的一种毁灭性病害。我国槟榔黄化病已由发病初期的海南省屯昌县蔓延至海南省琼海、万宁、陵水、文昌、琼中、定安、乐东、保亭、三亚、五指山等10余个市县，在海南不同地区的槟榔产区均有不同程度的发生，且发病地区及面积仍在不断扩大，严重影响我国槟榔产业健康可持续发展(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010)。植原体病害是系统性侵染病害，尚无有效治疗药剂，其扩散传播途径包括自然状态下的刺吸式口器昆虫、菟丝子传播和人为状态下的种苗、嫁接传播，从源头上杜绝病原是防止此类病害流行的最常用也是最根本的方法。因此，高灵敏度的植原体检测方法的建立在植原体病害各方面的研究中都至关重要，特别是在病害监测、种苗检疫及综合防治方面占据着无法替代的地位并发挥着关键作用。

槟榔黄化病在中国、印度和斯里兰卡均有报告(罗大全等,2001；车海彦等,2010a,2010b；周亚奎等,2010；Ramaswamy et al,2013；Silva et al,2015)。引起槟榔黄化病的病原包括16SrI-B亚组(Muddumadiah et al.,2014；周亚奎等,2010)、16SrI-G(车海彦等,2010a)、16SrXI组(Ramaswamy et al,2013)、16SrXIV组(Silva et al,2015)等不同组或亚组植原体株系。基于不同组或亚组的植原体目前已建立了巢式PCR(罗大全等,2001；车海彦等,2011)、实时荧光PCR(车海彦等,2011；Nair et al.,2014)、LAMP检测技术(Nair et al,2016)等检测技术。针对海南槟榔黄化植原体快速、便捷检测方面，车海彦等基于海南16SrI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针组合，建立了海南16SrI组槟榔黄化植原体实时荧光PCR快速检测方法(车海彦等,2011)。Nair等(2014)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16S rRNA基因建立起适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的SYBR green法实时荧光PCR技术。Nair等(2016)基于印度16SrXI组槟榔黄化植原体16SrRNA基因建立适合检测印度16SrXI组槟榔黄化植原体的LAMP检测体系。不同检测技术检测灵敏度差异较大，基于植原体16S rRNA基因序列构建重组质粒的灵敏度分析表明：巢式PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度的为3.17×10⁴copies/μL(任争光等,2015)；荧光定量PCR检测扩增灵敏度能达到的DNA模板浓度为3.17×10²copies/μL(任争光等,2015)；LAMP检测技术能达到的DNA模板浓度为5.3×10¹copies/μL(Yu et al,待发表数据)。