[发明专利]一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条包括：PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

将所述硝酸纤维素膜粘结在所述PVC底板的中部；将结合垫和吸水纸分别粘贴在所述硝酸纤维素膜的前、后两端，在所述样品垫的正上方设有样品孔；

所述硝酸纤维素膜上自靠近结合垫端依次设有检测线、质控线，所述检测线上包被有腐败梭菌多克隆抗体；所述质控线上固载有羊抗兔IgG抗体；

所述样品垫与结合垫的前端搭接；所述结合垫的后端与所述硝酸纤维素膜的前端搭接；所述吸水纸与硝酸纤维素膜的后端搭接，所述搭接的覆盖部分宽度为1-2mm；

该检测腐败梭菌的胶体金试纸条的制备方法，包括步骤：

（1）腐败梭菌抗体的制备：

甲醛灭活后的腐败梭菌菌体蛋白作为抗原，将抗原与弗氏佐剂混合后，免疫日本大耳白兔，取四免后的血清，采用亲和层析柱进行亲和纯化，制成腐败梭菌多克隆抗体；所述腐败梭菌多克隆抗体的效价为1:1024000；

（2）胶体金标记抗体的制备：

1) 胶体金溶液的制备：按柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，将98mL双蒸水加热至65℃，磁力搅拌下准确加入新鲜制备的质量分数为1%的氯金酸水溶液1mL，继续加热至95℃，迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液1mL，不断搅拌煮沸15min，待溶液颜色由黑—紫变浅酒红色时，停止加热，冷却至室温，获得胶体金溶液；

2) 胶体金标记的最适pH确定：用0.2mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，通过胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH值为8.0；

3) 抗体最适标记量的确定：采用蛋白梯度法确定腐败梭菌抗体稳定1ml胶体金所需的最小抗体量为10μg/ml，实际胶体金探针制备工作中，加入的抗体量为最小蛋白量的120%-130%，最终抗体浓度为12μg/ml-13μg/ml；

4) 胶体金-抗体结合物原液的制备和纯化：将最适pH胶体金溶液20ml加入腐败梭菌抗体中，使抗体浓度为12μg/ml-13μg/ml，并在室温下搅拌30min，制得胶体金-抗体结合物溶液；将10%BSA 2ml加入制得的终浓度0.4%的胶体金-抗体结合物溶液中，室温搅拌10min，或者加入10%聚乙二醇0.2ml，室温搅拌10min，9000-11000r/min离心40-60min，弃去上清，沉淀溶于2ml胶体金-抗体保存液中，用0.45μm滤膜过滤，所得即为胶体金-抗体结合物原液；在1ml胶体金-抗体结合物原液中加入10%NaCl水溶液1ml后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金-抗体结合物原液具有良好的稳定性；

5) 胶体金-抗体结合物原液工作浓度的确定：胶体金-抗体结合物原液经二倍倍比稀释试验测试，结果显示当胶体金-抗体结合物原液的工作浓度为1:4时，检测效果最佳；

（3）结合垫的制备：

用工作液将胶体金-抗体结合物原液按体积比1:4进行稀释，所述工作液为100ml体系：Tris-HCl 1.2114g，Triton X-100 1ml，氯化钠0.5884g，2g蔗糖，0.02%叠氮钠，溶于100ml超纯水中，调pH8.0；取1.4ml胶体金-抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37℃烤干，制成结合垫；

（4）设置检测线和对照线的硝酸纤维素膜的制备：

1) NC膜型号的选择：通过跑板功能测试、层析性能测试和重新选择试验，综合评定后，NC膜型号为赛多利斯CN140；

2) 检测线及质控线条件的建立和优化：将NC膜上T线及C线的包被抗体设置如下几个浓度梯度：1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml，选择显色效果最优的一组作为腐败梭菌抗体使用浓度和羊抗兔IgG抗体使用浓度；结果表明，检测显色效果最优的一组浓度：腐败梭菌抗体工作浓度为1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体工作浓度为1mg/ml；

3) T线及C线的点膜：用0.01mol/L pH8.0的PBS 将腐败梭菌抗体和羊抗兔IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜；T线与C线的距离为0.5cm，参数均为1ul/cm，喷好的NC膜置37 -45℃烤干干燥8h以上；

（5）胶体金试纸条组装：

将PVC底板切成宽2.8mm×长6cm的条；在PVC底板中间粘设置检测线和质控线的硝酸纤维素膜，距离上段1.5cm；在PVC底板下端粘贴结合垫，并与硝酸纤维素膜重叠0.1cm，然后在下端粘贴1.7cm宽的样品垫，样品垫与结合垫重叠0.1-0.2cm；在PVC底板上端粘贴1.7cm宽的吸水纸，并与硝酸纤维素膜重叠0.1-0.2cm；切成2.8mm宽的检测卡。