[发明专利]一种罗丹明活化酯的制备方法

说明书

本发明提供了一种罗丹明活化酯的制备方法，包括如下步骤：首先，将N‑羟基琥珀酰亚胺和三氟乙酸酐反应制备出三氟乙酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯；其次，将罗丹明类染料和三氟乙酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯溶解于有机溶剂中，充分反应，去除有机溶剂，提纯，制备出纯净度高的罗丹明活化酯。应用本申请所述的制备方法，副产物少，制备出的罗丹明活化酯不含有DCU杂质，产品纯度高，产率高，降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，尤其涉及一种罗丹明活化酯的制备方法。

背景技术

大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较差，因此人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低，这就是荧光探针技术。荧光分析方法因其灵敏度高、选择性好和试样量少，在分析化学，特别是生物分析中有广泛的应用。随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、多肽、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能。

目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、邻苯二甲醛类等，其中罗丹明类化合物在生物研究领域中占有及其重要的位置。罗丹明是一类具有优异光学性质的染料，与其他常用的荧光染料相比，罗丹明类荧光染料具有光稳定性好、长波长吸收、吸收系数大、开环形式的高光稳定性、对pH不敏感、较宽的波长范围和较高的荧光量子产率和荧光寿命长等优点。因此被广泛应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、环境化学、单个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等方面，是分析化学和生物医药科学在生物技术领域中最常用的荧光染料。

但是罗丹明衍生物在制备的过程中常采用碳二环己基亚胺(简称DCC)缩合的方法，如6-羧基四甲基罗丹明活化酯等，缩合剂碳二环己基亚胺在反应过程中自身转变成二环己基脲(简称DCU)，DCU的特点是微溶于有机溶剂，用过滤的方法可以除去大部分DCU，但少量的DCU是很不易去除干净，在与生物分子标记时，造成标记效率低，对下游产品的产率及质量有一定的影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是当前采用DCC缩合剂制备罗丹明活化酯的方法中，产品中会残留少量的DCU，很难彻底清除DCU杂质，影响下游产品的标记效率，为制备出纯度较高、不含DCU杂质的用于产品标记的罗丹明活化酯，本申请提供了一种罗丹明活化酯的制备方法。

为实现上述目的，本申请提供了一种罗丹明活化酯的制备方法，包括如下步骤：S1、将N-羟基琥珀酰亚胺和三氟乙酸酐置于室温下，充分反应，去除溶剂，得到三氟乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯；S2、首先，将罗丹明类染料充分溶解于有机溶剂中；其次，继续向所述有机溶剂中加入步骤S1中所述的三氟乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，充分反应，去除有机溶剂，得到粗罗丹明活化酯；S3、对步骤S2中所述的粗罗丹明活化酯进行提纯。

作为本申请的进一步改进，步骤S2中，所述的有机溶剂为DMF、二氯甲烷、乙腈中的任意一种。

作为本申请的进一步改进，所述罗丹明类染料为罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明123、罗丹明衍生物中的任意一种。

作为本申请的进一步改进，所述罗丹明衍生物为5-羧基四甲基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明中的任意一种。

作为本申请的进一步改进，步骤S2中，所述提纯的方法为萃取法。

作为本申请的进一步改进，步骤S1中，所述去除溶剂的方法为旋蒸法；步骤S2中，所述去除有机溶剂的方法为旋蒸法。

作为本申请的进一步改进，应用所述萃取法对步骤S2中所述粗罗丹明活化酯提纯的过程如下：首先，应用氯仿溶解步骤S2中所述的粗罗丹明活化酯，得到氯仿混合液；其次，将氯仿混合液转移至分液漏斗中，依次用水、饱和氯化钠洗涤，分层，收集有机相，蒸干，得到高纯的罗丹明活化酯。

作为本申请的进一步改进，所述罗丹明活化酯的纯度大于95％。