[发明专利]一种近红外分子探针及其制备和在检测颗粒酶B中的应用

说明书

本发明属于医学生物材料领域，具体公开了一种颗粒酶测定的近红外分子探针，此外还公开了所述的分子探针的制备方法以及将其用于颗粒酶近红外测定的方法。本发明所述的测定探针，当在颗粒酶B存在时，其能特异性的催化水解探针中的片段，再经分子化的环化反应，释放出荧光团。本发明制备出来的分子探针对颗粒酶B具有高选择性、灵敏度高；且制备方法简单合成条件不苛刻，操作方便。可实现对细胞毒性T细胞内颗粒酶B的原位检测，具有免洗、无荧光背景干扰等优势。

技术领域

本发明属于医学生物材料领域，特别涉及一种快速检测细胞毒性T细胞分泌的颗粒酶B 的近红外荧光探针的制备，以及通过监测颗粒酶B预测移植排斥反应。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以通过多种机制识别和杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。其中最主要途径是向靶细胞分泌颗粒成分，释放致命的溶细胞分子，这些颗粒含有颗粒酶原及其它蛋白酶原，包括穿孔蛋白。由于CTL细胞与靶细胞结合(经靶细胞表面的CTL受体和MHC分子的抗原结合)，颗粒的内容物释放，颗粒酶进入了靶细胞，穿孔蛋白进入了靶细胞通过在细胞膜的聚合形成了靶细胞膜的小孔，使细胞膜穿孔，最后穿孔蛋白使颗粒酶的膜穿孔引起颗粒酶的释放。现已发现CTL可以分别产生至少11种颗粒酶：颗粒酶A-颗粒酶M.在人类中发现了五种，即颗粒酶A(GzA)，颗粒酶B(GzB)，颗粒酶H(GzH)，颗粒酶K(GzK)和颗粒酶M(GzM)。其中，GzB是诱导细胞凋亡最活跃的。在细胞浆内，颗粒酶B能通过几种不同的途径激起细胞的死亡，首先激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解。

在组织和器官衰竭的晚期，移植已成为最有效的治疗方法。然而，移植排斥仍然是移植后最关键的并发症，也是影响移植物功能和存活的主要因素。当前用于检测移植排斥的金标准是组织活检，但其提供的预测信息有限，并且组织活检是一种侵入性工具，可能引起严重的并发症。与移植排斥相关的生物标志物的无创检测可以帮助临床医生在临床上明显的器官功能障碍之前采取个性化治疗并改善预后。许多研究表明，外周血，移植组织和受体尿中的 GzB mRNA水平较高。在急性排斥反应评估中，使用GzB做标志物可能是更好的选择，以指导异体移植活检的执行和更早的治疗干预。综上所述，免疫排斥部位GzB浓度的增加表明了移植排斥反应的发生，GzB可以用作急性排斥反应的早期预测指标。

目前，已经开发了一些用于动态监测和成像细胞内GzB的荧光传感器。Packard和Choi 等设计的探针，可基于荧光蛋白变异体之间的共振能量转移(FRET)报告蛋白酶活性。还有研究者开发了GzB的PET示踪剂(68Ga-NOTA-GZP)来监测肿瘤的免疫。然而这些显像剂的发射波长阻碍了它们在体内生物成像中的应用。

发明内容

为解决现有GzB测定存在的不足，本发明第一目的在于，提供了一种利用近红外测定 GzB的全新测定思路，并提供了一种可实现GzB近红外测定的全新结构的分子探针。

本发明第二目的在于，提供了一种所述的近红外分子探针的制备方法。

本发明第三目的在于，通过了一种所述的近红外分子探针在用于制备测定GzB的测试试剂中的应用。

本发明第四目的在于，提供了一种可测定GzB的测试试剂。

一种近红外分子探针，为具有式1结构式的化合物：

本发明开拓性地提出了一种基于近红外手段对颗粒酶B进行测定的全新思路；并创新地提供了一种可实现颗粒酶B近红外测定的全新结构的小分子探针化合物。本发明研究发现，该全新的分子探针能够特异地被GzB识别，可实现颗粒酶B的近红外实时检测和成像，不仅如此，还具有干扰小，灵敏度高、稳定性高等优势。

本发明还提供了一种所述的近红外分子探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：将具有式2结构式的化合物、丙烯酰卤、缚酸剂进行反应，得到式3中间产物；