[发明专利]用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC

说明书

本发明提供了用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒，它们涉及使用引物激活式恒温核酸扩增方法扩增待测样品DNA，得到扩增产物；其中，所述扩增引物由SEQ ID NO:17‑20表示的组合引物；和分析得到的扩增产物中是否存在艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位单核苷酸缺失。本发明所述的方法、引物和试剂盒能够在等温条件下便捷、高效，并以高特异性以及高灵敏度检测出艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC，从而解决了现有方法中存在的特异性不高、灵敏度较低、交叉污染率高、操作复杂、效率低下、成本高等问题。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile或C. difficile）是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，属于条件致病菌，目前是全球范围内公认的引起医院内感染和抗生素相关性腹泻的最为重要的病原微生物。临床上，约15%~25%的抗菌药物相关性腹泻，50%~75%的抗菌药物相关性结肠炎和95%~100%的伪膜性肠炎由CDI（艰难梭菌感染）引起。2013年，艰难梭菌被美国国家卫生部列为抗生素相关耐药菌中的三大病原菌之首，威胁程度指定为“最紧急”。我国也已将艰难梭菌研究纳入“十二五”国家传染病重大科技专项。艰难梭菌感染易出现抗生素耐药性、反复复发性、传染性、高致死性，因此艰难梭菌感染已对全球性公共卫生造成威胁。

在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国，CDI的潜在威胁远高于国际水平，临床需求较明确。2001年后，随着艰难梭菌高毒力菌株核糖体027型（RT027）的出现，艰难梭菌感染的发病率和严重程度在世界各地均呈上升趋势，已经成为令人担忧的健康问题。与其他基因型比较，艰难梭菌RT027更容易导致患者出现严重症状，是目前临床监测的重点。Genbank序列比对结果显示，RT027型毒力调节基因tcdC序列与参考株VPI10463（Genbank收录号：X92982）相比，RT027型菌株tcdC序列出现连续18个核苷酸（nt330-347）的缺失和第117位单核苷酸的缺失。

近几年，检测碱基突变的方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进。目前较为常见的方法主要包括传统的PCR-高通量测序技术和PCR-焦磷酸测序技术，以及新兴的ARMS-PCR技术（amplification refractory mutation system）、HRM技术（high-resolution melting analysis）、PNA-探针法以及流式荧光杂交等。然而，上述方法在碱基突变的检测中通常存在分析周期长、灵敏度低、特异性有限、成本高，或者操作繁琐复杂、对操作人员技术要求高、易造成样品污染、仪器平台复杂等问题。

因此，采用能够克服主流碱基突变检测方法的一个、多个或全部缺陷的改进的碱基突变检测方法来对艰难梭菌RT027进行检测，从而辅助艰难梭菌的快速检测，进而进行快速诊断，对于减少目前由于此种艰难梭菌耐药菌感染带来的病人死亡风险和国家及个人的经济损失是有重大意义的。

发明内容