[发明专利]一种乳酸菌的固定化方法及在制备果蔬饮料中的应用

权利要求书

1.一种乳酸菌的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）乳酸菌菌悬液制备

将保存的乳酸菌菌株分别用MRS液体培养基活化2~3次，然后接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养，取对数生长期培养液离心，收集菌体，菌体用无菌生理盐水制成乳酸菌菌悬液，活菌数≥1.0×10⁷ CFU/mL；

（2）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备

按体积比1:8~12的比例，将乳酸菌菌悬液和重量体积浓度2~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置片刻，然后用注射器吸取混合液，在距离液面25~35cm的高度以1.5~2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl₂溶液中，以150r/min转速搅拌，固化30~40min，过滤，胶珠用无菌去离子水洗去表面的CaCl₂溶液，于4℃冰箱中贮存备用；

（3）海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化

取碳点壳聚糖溶液，用1mol/L NaOH调节pH为6，添加与碳点壳聚糖溶液等体积的蒸馏水稀释，按重量比1: 8~12的比例将步骤（2）的海藻酸钠乳酸菌胶珠加入碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，胶珠用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，完成第一层碳点壳聚糖涂层；按重量比1: 8~12的比例，将第一层碳点壳聚糖涂层的乳酸菌胶珠与重量浓度0.10~0.20%的无菌海藻酸钠溶液在摇床中混合10~15min，过滤，用无菌去离子水洗涤胶珠，按重量比1: 8~12的比例将洗涤后的胶珠加入到碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌的固定化方法，其特征在于：乳酸菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.delbrueckii subsp）中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的乳酸菌的固定化方法，其特征在于：碳点壳聚糖溶液的制备方法如下：

（1）碳点合成：按重量体积比g:mL=1~3: 50~100的比例，将DL-丙氨酸加到去离子水中，超声20~30min后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下加热8~12h，自然冷却后，用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；

（2）碳点壳聚糖复合物制备：将步骤（1）水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖、重量浓度1%乙酸溶液混合，搅拌混合1~2h，即得碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:30~50，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:100~150。

4.权利要求1-3中任一项所述的乳酸菌的固定化方法制得的固定化乳酸菌在制备果蔬饮料中的应用，其特征在于：将果蔬去皮，切成果肉丁榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得果蔬原汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待果蔬汁冷却到室温后，与海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球按重量比1000~2000:1的比例混合得到混合物，同时加入还原糖、氨基酸，其中还原糖在混合物中的重量浓度为5~10%，氨基酸在混合物中的重量浓度为3~5%，混匀后，37℃发酵24~72h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球，发酵液即为乳酸菌果蔬饮料，或添加辅料进行调配，将得到的乳酸菌果蔬饮料贮藏于4℃冰箱中。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：还原糖为葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖中的一种或几种。