[发明专利]眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法

说明书

本发明公开了眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法。微卫星位点tSb‑SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGC；R:CTCACATTGACGAAAGGC。本发明发现了眼斑水龟微卫星位点tSb‑SSR12的新用途，该位点与眼斑水龟性别呈显著相关(P0.05)，因此能够应用于眼斑水龟雌雄遗传差异分析、成体和幼体性别鉴定等工作。

技术领域：

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法。

背景技术：

眼斑水龟(Sacaliabealei)隶属于龟鳖目(Tesudines)、地龟科(Geoemydidae)、眼斑龟属(Sacalia)，是中国特有淡水龟类，主要分布于广东、广西、海南、福建、安徽、江西、贵州、香港等地，在山区溪流中生活。眼斑水龟肉质细腻且无异味，滋补作用明显，具有很高的食用和药用价值，是一种重要的经济淡水龟。

在眼斑水龟养殖中，养殖种源主要从野外获取和补充，然而，近年来随着环境污染和破坏，眼斑水龟野外种群急剧减少。为了有效保护野生种质资源，发展养殖业，需要尽快增加眼斑水龟数量，扩大种群规模。在种源不足的情况下，因雌性可以产卵，增加雌龟养殖比例可以加快种群数量增长速度，提高经济产值。因此，在眼斑水龟发育早期鉴定其性别，对促进眼斑水龟水产养殖业的可持续发展具有重要作用。

由于三龄前幼龟第二性征分化不明显，雌雄个体间表型差异小，无法从形态上鉴别雌雄，而基于DNA分子标记技术的性别鉴定方法可以克服以上困难，通过筛选性别连锁分子标记在发育早期鉴定性别，目前，尚未见眼斑水龟性别相关微卫星标记的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物。

本发明的眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物如下所示：

微卫星位点tSb-SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGC

R:CTCACATTGACGAAAGGC

本发明通过分析7个眼斑水龟微卫星标记在雌雄群体中的扩增结果，发现了微卫星位点tSb-SSR12与眼斑水龟性别显著相关，并进一步扩大雌雄群体样本量对该位点与性别的相关性进行了验证，在64个雌雄样本中扩增的结果表明，微卫星位点tSb-SSR12与眼斑水龟性别显著相关。说明本发明筛选出的tSb-SSR12微卫星标记的特异性引物不仅能够用于眼斑水龟的遗传多样性水平评估、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等工作，而且可用于雌雄眼斑水龟遗传差异分析、幼体性别鉴定等工作。

本发明的第二个目的是提供鉴别眼斑水龟性别的方法，其是将待测眼斑水龟进行基因组DNA提取，然后以上述眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测和相关性分析，鉴别待测眼斑水龟的性别。

所述的PCR扩增，其反应体系为：

所述的PCR扩增，其反应程序为：

PCR反应程序

本发明的第三个目的是提供一种鉴别眼斑水龟性别的试剂盒，其含有上述眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物和PCR反应试剂。

本发明发现了眼斑水龟微卫星位点tSb-SSR12的新用途，该位点与眼斑水龟性别呈显著相关(P0.05)，因此能够应用于眼斑水龟雌雄遗传差异分析、成体和幼体性别鉴定等工作。

附图说明