[发明专利]mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用

说明书

本发明涉及“mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用”。本发明鉴定了一个新的参与母细胞裂解的苏云金芽胞杆菌基因mclX，mclX基因缺失可完全阻断母细胞裂解，并且不影响芽胞形成和Cry1Ac蛋白的产量，GFP定位在细胞质中。mclX的缺失影响母细胞裂解关键水解酶CwlC的转录和蛋白形成。本发明表明MclX是母细胞裂解途径的关键因子，其编码基因的缺失可实现细胞壁对杀虫晶体的包裹，对于构建高持效性的苏云金芽胞杆菌工程菌有重要帮助，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及mclX基因在苏云金芽胞杆菌母细胞裂解中的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性菌属蜡样芽胞杆菌家族(B.cereus group)。(Bacillus cereus group，Bc)(Vilas-Boas GT,Peruca AP,Arantes OM(2007)Biology and taxonomy of Bacillus cereus,Bacillus anthracis,and Bacillus thuringiensis.Can J Microbiol 53(6):673-687 doi:10.1139/W07-029)。Bt最显著的特征是其在形成芽胞的过程中会在同一母细胞中产生一个或多个伴胞晶体(Vilas-Boas G T, Peruca A P,Arantes O M.Biology and taxonomy of Bacilluscereus,Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis[J].Can J Microbiol.,2007,53(6):673-687.)。伴胞晶体主要由具潜在杀虫活性的杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystal Proteins，ICPs,又称 delta内毒素)Cry和Cyt蛋白组成(Bravo A,Likitvivatanavong S,Gill S S,et al.Bacillus thuringiensis:A story of asuccessful bioinsecticide[J].Insect Biochem Mol Biol., 2011,41(7):423-431；Vilas-Boas G T,Peruca A P,Arantes O M.Biology and taxonomy of Bacilluscereus,Bacillus anthracis,and Bacillus thuringiensis[J].Can J Microbiol.,2007,53(6):673-687.)Bt制剂杀虫谱广、对人畜无害、不污染环境，是世界上应用最广、产量最大的生物杀虫剂。但是，与传统的化学农药相比，Bt制剂在田间应用稳定性差、持效期短、杀虫效率相对较低，成为制约其进一步推广应用的瓶颈(Talkhan F.N., Abo-AssyH.H.,Azzam M.M.,Abdel-Razek A.S.Activity of delta-endotoxin protein crystalsin Bacillus thuringiensis mutants when influenced by UV treatments.Archivesof Phytopathology and Plant Protection,2013,46(11):1346-1358.)。复杂的田间环境密切影响Bt制剂的应用，如温度、雨水、阳光辐射等均影响Bt制剂的应用稳定性，尤其是阳光中的紫外辐射(Ultraviolet,简称UV)被认为是最关键的影响因素(Morlot C., UeharaT.,Marquis K.A.,Bernhardt T.G.,Rudner D.Z.A highly coordinated cell walldegradation machine governs spore morphogenesis in Bacillus subtilis.GenesDev, 2010,24(4):411-422.)。Bt制剂中发挥杀虫活性的主要有效成分为杀虫晶体蛋白，当其暴露在阳光中的紫外辐射下时，氨基酸被氧化、色氨酸与组氨酸残基被破坏、以及产生自由基等，造成了晶体蛋白的失活，从而丧失杀虫活性(Pozsgay M.,Fast P.,Kaplan H.,Carey P.R.The effect of sunlight on the protein crystals from Bacillusthuringiensis var. kurstaki HD1 and NRD12:a Raman spectroscopic study.Journalof Invertebr Pathol, 1987,50(3):246-253.)。σ^k缺失可以阻止母细胞裂解，但是Cry蛋白产量会受影响，过量表达Cry1Ba不影响其杀虫活性，晶体在母细胞的包裹下有效降低了对紫外线的敏感度(Bravo A,Agaisse H,Salamitou S and Lereclus D.1996.Analysisof crylAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis.MolGenet Genomics.250:734-741；Zhou CM,Peng Q,Du LX,Shu CL,Zhang J,SongFP.2014.Screening of cry-type promoters with strong activity and applicationin Cry protein encapsulation in a sigK mutant[J]. Appl MicrobiolBiotechnol.98:7901–7909.)，证明可以通过构建细胞壁不裂解菌株，避免晶体蛋白失活。