[发明专利]一种优化提取龟甲蛋白肽工艺及细胞增殖活性分析方法

说明书

一种优化提取龟甲蛋白肽工艺及细胞增殖活性分析方法，属于动物药提取技术领域，本发明通过响应面优化试验，分别对提取时间、提取温度、料液比进行优化，确定了提取TS、PTS蛋白肽的最佳工艺条件，使龟甲蛋白肽的含量最高可达15.16％，为龟甲蛋白肽的进一步开发应用提供了研究基础。研究不同质量浓度的TS、PTS蛋白肽及其分级组分对细胞增殖活性的影响，结果表明，不同组分在同一质量浓度为范围内，对细胞均有一定的增殖能力，且活性随着浓度的升高而升高，有剂量依赖性，1kDa组分活性最佳，故1kDa寡肽组分是龟甲促进成骨细胞增殖活性的物质基础，且醋龟甲活性强于龟甲，炮制后活性增强。

技术领域

本发明属于动物药提取技术领域，涉及一种优化提取龟甲、醋龟甲蛋白肽的方法及其分级组分对MC3T3-E1细胞增殖活性的分析方法。

背景技术

动物药中的主要成分是蛋白质、肽、氨基酸，且其具有较好的活性。龟甲(Tortoiseshell，TS)是中医临床常用的抗骨质疏松药物，具有滋养肾阴之功效，可生髓益肾强骨，固经止血，补心安神，其主要含有胶原蛋白、肽、氨基酸等成分。龟板可显著提高激素性骨质疏松小鼠的骨密度、骨小梁厚度、骨矿物质含量、骨表面积等，龟甲胶可促进软骨细胞增殖，抑制其凋亡，并可促进骨髓间充质干细胞增殖并分化为成骨细胞。醋龟甲(Processedtortoise shell，PTS)散剂可显著提高骨质疏松小鼠股骨的钙、磷含量，灰质量，灰质量/去脂干质量；

超滤技术在医药领域应用广泛，可用于蛋白质的脱醇、脱盐、浓缩与分级分离。目前龟甲蛋白肽提取工艺及其分级组分对成骨细胞细胞(MC3T3-E1)的增殖活性的研究尚未开展。

成骨细胞活性失衡导致的骨量减少可导致骨质疏松，MC3T3-E1细胞系是从新生的C57BL/6小鼠颇顶骨中分离培养的成骨细胞系，其具有碱性磷酸酶活性、胶原合成及基质矿化等成骨细胞的生物学特性，并能够表达一定水平的成骨分化相关基因和蛋白。该细胞系是体外研究成骨细胞分化的良好模型，也是研究药物对成骨细胞活性影响的理想细胞模型。

龟甲生品质地坚硬，并伴有腥臭气味，炮制后质地松脆，易于粉碎，有效成分更易溶出，同时可降低其腥臭味，便于服用，增加患者顺应性，且滋阴作用增强。本发明以受试药物促进MC3T3-E1细胞增殖活性作为筛选指标，评价龟甲、醋龟甲蛋白肽分级组分的活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种优化提取龟甲蛋白肽工艺及细胞增殖活性分析方法，采用超滤法将龟甲蛋白肽分级为不同组分，将各超滤组分通过CCK8检测对MC3T3-E1增殖活性的影响。

一种优化提取龟甲蛋白肽工艺及细胞增殖活性分析方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、样品的制备

取龟甲10g，粉碎至粒径为50目，取龟甲质量8～16倍量的蒸馏水，添加至粉碎后龟甲中，在提取温度为10～30℃条件下，恒温水浴磁力搅拌提取1～5h，收集提取液，离心，转速为3600r/min，离心10～20分钟后，取上清液；

步骤二、制备冻干粉

将所述步骤一中获得的上清液经过双层滤油纸抽滤后，经过0.45μm滤膜微滤、1kDa、3kDa、10kDa超滤膜超滤，得到分级组分：总提取物为组分1，分子量Mw10kDa为组分2，分子量Mw：3～10kDa为组分3，分子量Mw：1～3kDa为组分4，分子量Mw1kDa为组分5，获得五个组分冻干粉备用

步骤三、标准曲线的测定

分别精密量取牛血清白蛋白BSA标准溶液0、100、200、300、400、500μL置于试管中，用蒸馏水补足至1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，混匀，室温静置5min，以加入0μL牛血清白蛋白标准溶液管为参比，于595nm处测定吸光度值，标准蛋白质量浓度作为横坐标x，将595nm吸光度值作为纵坐标y，绘制标准曲线；