[发明专利]报告基因重组细胞用于定量检测二恶英及筛查芳香烃受体活性物质的方法

权利要求书

1.一种利用荧光素酶报告基因重组细胞CBG2.8D对二恶英类化合物进行定量检测的方法，包括如下步骤：

(A1)将荧光素酶报告基因重组细胞CBG2.8D按照4×10⁴细胞/孔接种到96孔板，培养24h；

(A2)将待测样本溶于DMSO，得到待测样本的DMSO溶液；

(A3)将(A2)所得待测样本的DMSO溶液和细胞培养基混合，所述待测样本的DMSO溶液中DMSO的体积和所述细胞培养基的体积之比为1:100，得到待测样本培养液；

(A4)用(A3)所得待测样本培养液替换(A1)中96孔板内的细胞培养基，继续培养24h；

(A5)去掉(A4)中的所述待测样本培养液，使用细胞裂解液对细胞进行裂解，得到待测样本裂解液；将所述待测样本裂解液与荧光素酶底物蛋白混合后上机检测荧光素酶发光值，然后根据标准曲线计算所述待测样本中二恶英类化合物的含量；

所述二恶英类化合物为2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英；

步骤(A5)中，将所述待测样本裂解液的荧光素酶发光值的有效检测上限设置为所述标准曲线最高发光值的75％；

步骤(A5)中，所述标准曲线按照包括如下步骤的方法制备得到：

(a1)将荧光素酶报告基因重组细胞CBG2.8D按照4×10⁴细胞/孔接种到96孔板，培养24h；

(a2)毒性当量为1的二恶英单体2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英作为标准物质溶于DMSO，然后进行3倍比梯度稀释，得到二恶英单体2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英浓度从1×10^-7mol/L起至1.52×10^-11mol/L止共9个浓度点，同时设置一个二恶英单体2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英含量为0的浓度点，最终得到已知浓度的系列标准品的DMSO溶液；

(a3)将(a2)所得所述系列标准品的DMSO溶液分别和所述细胞培养基混合，所述系列标准品的DMSO溶液中DMSO的体积和所述细胞培养基的体积之比为1:100，得到系列标准品培养液；

(a4)用(a3)所得所述系列标准品培养液替换(a1)中96孔板内的细胞培养基，继续培养24h；

(a5)去掉(a4)中的所述系列标准品培养液，使用细胞裂解液对细胞进行裂解，得到系列标准品裂解液；将所述系列标准品裂解液与荧光素酶底物蛋白混合后上机检测荧光素酶发光值，然后根据2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英的含量和对应的荧光素酶发光值绘制标准曲线；

步骤(A3)中，所述待测样本培养液中二恶英类化合物的含量范围为：高于1.5×10^-13mol/L且低于1.1×10^-10mol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养基为α-MEM完全培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A1)和(a1)中，将所述荧光素酶报告基因重组细胞CBG2.8D接种到96孔板时，选取96孔板中间的60个孔进行接种，外围一圈孔中加入等体积PBS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A5)中，去掉(A4)中的所述待测样本培养液后，还包括用PBS缓冲液清洗细胞的步骤；步骤(a5)中，去掉(a4)中的所述系列标准品培养液后，还包括用PBS缓冲液清洗细胞的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A5)和(a5)中，所述裂解的时间为15-30min。