[发明专利]一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法

权利要求书

1.一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物，其特征在于，根据胶孢炭疽菌生理小种C.fructicola、C.siamense和C.aenigma对应的多个菌株的cutinase基因共有序列设计引物，包括两条引物Cfcut1和Cfcut2，扩增产物115bp，所述共有序列如SEQ ID NO.1所示，引物核苷酸序列如下：

Cfcut1：5’-AGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；

Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTA-3’。

2.一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR试剂盒，其包括权利要求1所述的两条引物Cfcut1和Cfcut2，终浓度各为200～300nM。

3.一种草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法，以样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物Cfcut1和Cfcut2进行PCR扩增，退火温度为60℃，反应结束后通过琼脂糖凝胶检测扩增产物，根据产物片段大小判断胶孢炭疽菌的有无，若存在115bp的扩增产物条带，则样品中含有胶孢炭疽菌。

4.根据权利要求3所述草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法，其特征在于，所述样品DNA为真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA。

5.一种对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的快速检测方法，包括以下步骤：

1)以10倍等浓度梯度稀释的胶孢炭疽菌标准品质粒系列为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，获得对应标准品的循环数Cq值，利用获得的循环数Cq值和相应的质粒模板拷贝数作图，获得标准曲线方程；

2)以草莓样品基因组DNA为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，95℃2分钟；95℃15秒，60℃10秒，40个循环；反应结束后，获得样品的循环数Cq值，代入标准曲线方程，计算出样品中的胶孢炭疽菌的起始拷贝数。

6.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述标准曲线方程为Y＝-3.3348(log₁₀X)+34.726，Y为循环数Cq值，X为起始拷贝数，相关系数R²值0.9992。

7.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增中，引物Cfcut1和Cfcut2的扩增效率为99.47％。

8.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增程序采用两步法，退火温度为60℃，扩增体系中引物浓度各为100nM。

9.如权利要求1所述快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物在草莓炭疽菌检测中的应用。