[发明专利]删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用

说明书

本发明提供一种删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用。所述方法包括以下步骤：1)将稳定载体导入罗氏真养菌中获得转化体，其中，所述稳定载体中的所述冗余片段的上游和下游各有1个重组酶特异性识别的核苷酸序列，并且所述稳定载体包含par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA、parB、识别序列parS，复制蛋白repA，以及所述冗余片段；2)向所述转化体中导入表达所述重组酶的帮助质粒，经重组实现所述冗余片段的删除。本发明可以消除工业菌株中使用抗性基因所造成的抗性基因扩散到自然界的潜在隐患。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种删除稳定载体上冗余片段的稳定载体的方法及采用该方法得到的稳定载体。

背景技术

罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，也被称作Cupriavidus necator)是研究PHA(聚羟基脂肪酸酯，一种完全可降解的生物基材料)合成的重要模式细菌，有潜力作为PHA工业生产的菌株。把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞)，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体(vector)，而质粒是最常用的一种载体。在Ralstonia eutropha的菌种研发和工业生产中，经常使用质粒载体引入外来基因达到优化菌种的目的。

在构建质粒载体和选择宿主菌时要考虑到大规模生产中高产率问题及发酵和后续纯化中可能遇到的相关问题。质粒稳定性是质粒生产中经常遇到的问题之一，质粒的不稳定性指的是重组菌在培养过程中发生突变或丢失，结果使重组菌失去了原有的表型特征。质粒的分离不稳定是细胞分裂后子代细胞分离时引起的不稳定。由于质粒在子代细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含有质粒，这也是质粒丢失的重要原因。在一般实验中，通常可以利用抗生素施加选择抗性以维持质粒稳定，但是考虑到工业发酵的体量，在实际生产中添加抗生素会大大增加成本。

par系统是用于稳定保持质粒的系统，par系统启动后，质粒复制后就被均匀分配到子细胞中，所以即使不通过抗生素抗性施加选择选择抗性也能获得稳定保有质粒的菌株(Salje J,Gayathri P,J.The ParMRC system:molecular mechanisms of plasmidsegregation by actin-like filaments[J].Nature Reviews Microbiology,2010,8(10):683-692.)。目前已经开发出一种利用par系统构建的，可以以Ralstonia eutropha为宿主、且不施加抗生素选择压力也能稳定保持的质粒载体。该载体使用耐金属贪铜菌CH34的巨大质粒pMOL28的par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA28、parB28和识别序列parS。同时该载体上带有大肠杆菌复制子及卡那霉素抗性基因，以便于在大肠杆菌中进行载体改造相关的遗传操作(参见中国发明专利申请公开号CN101297036A)。

一般情况下，保持质粒的存在以及质粒的复制都需要依赖宿主细胞的代谢产生的能量，质粒拷贝数过高或质粒过大等会加重宿主细胞的代谢负担，严重的甚至影响宿主细胞生长(Karim A S,Curran K A,Alper H S.Characterization of plasmid burden andcopy number in Saccharomyces cerevisiae for optimization of metabolicengineering applications[J].Fems Yeast Research,2013；13(1):107-116.)。由于外源基因的大小通常不便于调节，在载体设计时就需要尽量精简，避免无效基因造成的复制负担。在质粒转化过程中，往往要依靠载体上的抗性基因对受体菌进行抗生素的压力筛选，以确保得到带有质粒的转化体。但对于稳定质粒载体而言，在质粒转入受体菌后，由于不再需要抗生素，载体上的抗性基因则失去利用价值，成为“无效”片段。