[发明专利]同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法

权利要求书

1.一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，其特征在于：所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗包含重组腺病毒rAd-H5H9HA；所述重组腺病毒rAd-H5H9HA包含融合基因H5H9HA，所述融合基因H5H9HA由禽流感H5亚型血凝素抗原HA基因和禽流感H9亚型血凝素抗原HA基因融合而成；所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQID NO：1所示；所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，包括如下步骤：

S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：首先，制备所述融合基因H5H9HA，然后，在所述融合基因H5H9HA序列的一端加上kozak序列后再增加EcoRI酶切位点，在另一端加上NheI酶切位点；然后，将预处理后的融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，得到带有目的融合基因H5H9HA的所述质粒pUC57-H5H9HA；

S2，腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建：采用限制性内切酶EcoRI和NheI对腺病毒穿梭载体pDC315和所述质粒pUC57-H5H9HA进行双酶切处理，得到双酶切后的腺病毒穿梭载体pDC315片段和双酶切后的融合基因H5H9HA片段，然后进行连接反应，得到所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA；

S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁：运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA进行包装和扩繁，得到四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；

S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化：设计所述融合基因H5H9HA的上游引物和下游引物，进行PCR鉴定、扩增和纯化处理，得到大量纯化后的所述重组腺病毒rAd-H5H9HA，然后进行冻干、分装处理，制备得到所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗；

步骤S1的具体过程为：

1、筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列；将H5N6的HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除后，紧接H9N2中HA基因序列的起始密码子，直至H9N2中HA基因序列的终止密码子，使H5N6的HA基因和H9N2的HA基因融合成为一个融合基因H5H9HA，所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

2、在H5N6 HA基因序列的启动子之前加上kozak序列GCCACC，并在该kozak序列之前增加EcoRI酶切位点；在H9N2HA基因序列的终止子后边增加了NheI酶切位点；

3、用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒将融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，形成带有目的融合基因H5H9HA的质粒pUC57-H5H9HA；

在步骤S2中，还包括对所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的鉴定处理，具体过程为：将连接反应得到的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA转化入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落小提质粒，用NheI/XmaI一次双酶切鉴定出阳性克隆，然后进行测序，确认目的融合基因H5H9HA是否成功克隆入所述腺病毒穿梭载体pDC315中；

在步骤S3中，重组腺病毒载体的包装和扩繁的具体步骤如下：

P1，运用AdMax腺病毒包装体系，将所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA与辅助包装质pBHGlox(delta)E1,3Cre通过LipofectamineTM 2000共转染至293细胞中；

 P2，利用Cre/loxP重组酶系统实现重组，产生重组腺病毒的细胞中出现典型的细胞病变效应，待预定比例的细胞出现典型的细胞病变后，收集毒液，进行后处理，制备得到Ad-H5H9HA病毒原液；

P3，将步骤P2制备的所述Ad-H5H9HA病毒原液，用细胞维持液按照1:10的比例稀释然后感染新的293细胞，重复步骤P1和步骤P2的过程重复三次，制备出所述四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；

在步骤S4中，所述融合基因H5H9HA的上游引物为5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’；

下游引物为5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’。