[发明专利]肝包虫基因片段筛选方法、扩增引物及试剂盒

说明书

肝包虫基因片段筛选方法、扩增引物及试剂盒，该筛选方法通过从细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的全基因组中排出人类基因组、近亲缘关系绦虫组基因组的影响，筛选得到第三细粒棘球绦虫基因片段、第三多房棘球绦虫基因片段和共同基因片段，并分别以三类基因片段设计三类扩增引物；通过进一步筛选得到用于检测人体组织的包虫病的引物对组，基于该引物对组提供试剂盒及试剂盒使用方法。本发明从根源上避免了由于待检测组织DNA中存在的人类基因或近亲缘关系绦虫基因所导致的假阳性，且引物在设计时所针对的待检测DNA为人体组织样本，显著降低了临床检测中的假阴性结果，特异性引物的准确率更高、特异性更强，显著增强引物对和试剂盒的临床应用效果。

技术领域

本发明涉及包虫病诊断领域，具体涉及一种肝包虫基因片段筛选方法，基于该方法筛选得到的引物，用于检测人体组织的包虫病的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

包虫病，又称棘球蚴病，是因棘球绦虫幼虫寄生于人或动物体内，引起的一种人兽共患的寄生虫病。我国西藏、新疆、宁夏、甘肃、内蒙、青海等畜牧业发达地区为包虫病流行区，受威胁人口接近6600万。西藏地区是全国包虫病疫情最严重的省份之一，调查显示，包虫病流行区人群平均患病率为1.66％，约4.99万人，早期感染人数不低于10万人。

包虫病的感染可导致肝、肺、脑及骨骼等器官和组织的损害，病人丧失劳动能力，是部分农牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因之一。同时，包虫病还具备可传染、可潜伏、感染早期难以检测的寄生虫病特征，若扑杀不完全，会给疫区民众带来“因病致贫”的沉重负担。

中国的包虫病主要包括囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE)和泡型包虫病(alveolar echinococcosis,AE)，其中，囊型包虫病由细粒棘球绦虫(Echinococcosisgranulosus,Eg)的幼虫棘球蚴寄生人体组织器官所致，而泡型包虫病由多房棘球绦虫(Echinococcosis multilocularis,Em)的幼虫泡球蚴寄生所致。泡型包虫病病人如不治疗，10年病死率可达94％，又被称为“虫癌”。

传统的包虫病诊断方法中，B超、CT等影像技术以及病理检查因自身限制，容易造成小病灶、非典型病灶的误诊、漏诊和分型困难；血清筛查缺乏有效手段，ELISA，IHA和dot-ELISA等免疫学检测敏感性较低，不适用于人群筛查及随访。

为了解决上述问题，专利CN107164479A公开了一种用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合及试剂盒，其基于细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫已知的数个基因型设计多重PCR引物，采用多重PCR方法检测和鉴定三种人包虫病病原，特异性强、灵敏度高。但是，由于该引物对组合基于特定数个的细粒或多房棘球绦虫的基因型进行设计，未排除人类基因及其他绦虫基因的影响，检测时无法排除假阳性；同时，这些引物在设计时所针对的待检测DNA主要为绦虫虫体DNA样本，当推广到临床包虫病患者肝脏感染病灶时，容易出现假阴性的结果，造成误诊；此外，多重PCR法虽然能够实现同一体系、同一反应条件下同步检测两个以上的不同靶基因，但引物对之间也易发生互补结合、产生干扰反应，导致特异性较差、诊断结果不可靠。专利CN109762910A提供了一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒，能够实现通过单管PCR扩增即可对三个棘球绦虫种单独或混合感染引起的两型包虫病进行诊断和鉴别。同理地，该诊断方法也采用多重PCR法，且该引物的设计基于狭义细粒棘球绦虫、加拿大棘球绦虫和多房棘球绦虫线粒体基因参考序列，未采用绦虫的全基因组，也未排除人类基因及其他绦虫基因的影响，应用于临床时容易出现假阳性结果，特异性较差甚至无法扩增。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种肝包虫基因组特异性序列的筛选方法，该方法基于细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及其余人类易感且已知全基因组数据的绦虫的全基因组数据，进行BLAST比对、mummer比对，排除了人类基因组、非细粒或多房棘球绦虫基因组的污染影响，筛选出细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫共同的基因片段，以及两种绦虫各自的差异基因片段。