[发明专利]检测肺癌相关基因甲基化在制备检测肺癌试剂盒中的应用

说明书

本发明涉及诊断人LOC148898、VACM1、RNS4甲基化的方法和试剂盒。具体为通过协同检测三种肺癌标志物的甲基化DNA来诊断肺癌、提高肺癌检出率，所述的肺癌标志物是人LOC148898、VACM1、RNS4基因。本发明的试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对肺癌的筛查，无创性、检测率高且针对性强，有利于肺癌的早期发现和及时治疗。

技术领域

本发明涉及分子生物检测技术，具体地说，涉及一种与肺癌相关的多基因甲基化协同检测试剂盒。

背景技术

肺癌，又称原发性支气管癌，是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，其死亡率居各类恶性肿瘤之首。在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点，但早期发现对癌症患者的有效治疗至关重要。目前，临床症状出现以后进行组织学和细胞学检查是肺癌诊断的金标准，但早期肺癌由于常无特殊症状而几乎不被医生和患者察觉，用常规的诊断方法也难以早期发现和早期定性诊断，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。由于临床表现具有个体差异，多数患者就诊时已发展至晚期，因此早发现、早诊断、早治疗对延长肺癌恶性肿瘤患者生存期和降低死亡率有着重大意义。

与肺癌诊治有关的技术手段在不断改善，包括检测异常的基因突变，表观遗传修饰和利用免疫系统的潜力来控制肿瘤的生长等。而肿瘤标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗的新领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响；其中一个领域就是甲基化DNA检测。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共价结合到DNA分子的胞嘧啶(C)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，但并不改变DNA的序列。近年来的研究表明，肺癌的发生发展与抑癌基因启动子区CPG岛甲基化导致的抑癌基因表达失活有关,且其可能发生在肺癌的早期,是一个很有潜力的早期诊断肺癌的分子指标。因此，联合检测多个基因启动子的甲基化状态，对肺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。

目前现有技术中已经通过高通量测序，证明成百上千种基因的甲基化与肺癌的发生发展相关，然而高通量测序成本高昂，并且技术复杂，而目前已有的肺癌试剂盒大多为单基因检测，然而同一基因异常甲基化的DNA只占全部DNA的极小部分，大约0.1％～1％，这些非甲基化DNA与甲基化DNA只存在微小的差异，需要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。另外循环血中的DNA通常都已经降解(通常为几十到一百多碱基对)的片段，所以需要特别的抽提和检测技术才能获得较高的灵敏度。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种多基因甲基化协同检测试剂盒，更为具体的，所述多基因甲基化协同检测为针对人LOC148898(NCBI Reference Sequence:NM_138479.2)、VACM1(NCBI Reference Sequence:NM_003478.3)和RNS4(NCBI ReferenceSequence:NM_194430.1)基因甲基化的联合检测。

在本发明的第一方面，提供一种用于检测肺癌的试剂盒，所述的试剂盒中包括：特异性检测人LOC148898、VACM1和RNS4基因的DNA甲基化的检测试剂。作为优选的，所述试剂盒中包含检测人LOC148898、VACM1和RNS4基因甲基化的引物。更为优选的，所述LOC148898基因上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述VACM1基因上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述RNS4基因上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方案中，所述甲基化检测试剂盒，还包括：1×master和25mM MgCl₂。

在一种实施方案中，所述甲基化检测试剂盒，还包括：阳性对照和阴性对照。

在本发明的另一方面，提供一种肺癌早期检测用甲基化标志物的检测方法，包括如下步骤：