[发明专利]核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该核苷酸选自如下核酸序列中的一种：核酸序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的一个序列；或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4一致性不低于80％的核酸序列。本发明启动子优化的RNAi药物具有治疗和预防COL8A2基因Q455K突变引起角膜营养不良的作用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。

背景技术

角膜营养不良(Corneal dystrophy，简称CD)是一种遗传性眼科疾病，发病年龄多在20岁以上，患者的角膜组织中的细胞因基因突变使得其功能和结构发生进行性改变，角膜组织异常物质进行性沉积是其病理组织学特征。根据角膜营养不良的角膜累及层次将CD分类为四大类：角膜上皮及上皮下层营养不良、角膜前弹力层营养不良、角膜基质层营养不良和角膜后弹力层及角膜内皮层营养不良。其中角膜内皮细胞营养不良包括FECD(Fuchs角膜内皮细胞营养不良，Fuchs endothelial corneal dystrophy,FECD)、PPCD(后部多形性角膜内皮营养不良，Posterior polymorphous corneal dystrophy,PPCD)、CHED(先天性角膜内皮细胞营养不良，Congenital hereditary endothelial dystrophy,CHED))、XECD(X连锁性角膜内皮营养不良(X-linked endothelial corneal dystrophy,XECD))，都是因遗传因素导致角膜内皮细胞功能障碍，其中FECD是最常见的类型。

COL8A2基因编码α2多肽胶原Ⅷ型蛋白(α2polypeptide of collagen typeⅧ)。α2多肽胶原Ⅷ型蛋白由角膜内皮细胞分泌，是后弹力层的重要组成部分。COL8A2基因突变中的Q455K会影响α2多肽胶原Ⅷ型蛋白的三螺旋结构域，导致该蛋白三级结构发生显著改变，致使角膜后弹力层胶原网架分裂，进一步导致FECD。

RNA干扰(RNAi)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰RNA(small interference RNAs,siRNA)诱导产生的一种转录后基因沉默现象。RNAi作用机制可分为2个部分：1)扩增与起始阶段，具有特异序列的dsRNA进入细胞后一方面在RNA依赖的聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)作用下呈指数级扩增，得到大量针对靶序列的RNA。一方面在Dicer酶的作用下，形成21～23nt的含有2～3nt的3′突出端的siRNA。2)效应阶段，siRNA结合到核糖核苷酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端，被切割后的断裂mRNA随即降解。

在哺乳动物细胞中，RNAi可以由直接导入的siRNA诱导，也可以通过DNA载体如质粒、病毒载体或PCR产物的发夹结构表达shRNA(hairpin RNA)来诱导，对后一种方法而言，由DNA载体介导的RNAi反应能克服siRNA不能在哺乳动物细胞中复制的问题，但是其产生的shRNA数量受不同启动子的影响，进而影响RNAi效率。目前常用的表达shRNA的启动子是RNA聚合酶Ⅲ启动子如U6启动子、H1启动子和tRNA启动子，这些启动子在真核细胞内高效快速转录小片段基因，能避免RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的长颈环样RNA引起的干扰素反应，RNA聚合酶Ⅲ启动子转录小片段基因形成的短颈环结构能在细胞质中被Dicer酶切割产生siRNA，进而诱导RNAi发生。不同启动子对其下游的小片段基因的转录强度不同，产生的siRNA丰度也不同，故筛选高效的启动子对提高RNAi药物的有效性非常重要。

发明内容