[发明专利]一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备免疫接种的小鼠：

取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍；

⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；

⑶按第三次免疫蛋白的剂量将REG1α蛋白溶解后向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 mL：30 mL加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；

⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；

⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，充分分散后离心去上清液，得到沉淀物；

⑹所述沉淀物中按体积比1 mL：2 mL加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；

⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×10⁵个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，根据细胞生长情况从第六天开始，每隔2~3天用每孔100 μL HAT液换液一次；

当孔中出现杂交细胞集落，达到每个细胞集落细胞数30~50个时即可每孔取培养上清液100μL进行抗REG1α蛋白抗体的检测；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至检测培养上清的抗REG1α蛋白抗体阳性，则确定为所需的杂交瘤细胞；

⑻单抗的筛选分离：

将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；

⑼大量制备单克隆抗体：

将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。

2.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法或放射免疫测定RIA。

3.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。

4.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO₃调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。