[发明专利]一种脊髓成纤维细胞的制备方法

权利要求书

1.一种脊髓成纤维细胞的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；

2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液终止消化，离心，取下层固体，加培养液重悬；

3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。

2.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤1)所述脊柱组织是包含脊髓的新鲜脊柱组织。

3.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：所述含双抗的磷酸盐缓冲液是含1％双抗的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值7.4。

4.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：所述培养液是含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基。

5.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述干净组织剪成0.5-1mm³的块状；所述干净组织与含双抗的磷酸盐缓冲液的质量体积比1～5g：10ml，优选1g：10ml；所述加含双抗的磷酸盐缓冲液离心的速度1000rpm/min，时间3min。

6.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述胰蛋白酶溶液的加入量为下层组织块的10倍量v/w，ml/g；所述加胰蛋白酶溶液消化时间10～20min，优选15min；所述终止消化的培养液加入量为胰蛋白酶溶液的2倍量v/v，ml/ml；所述离心的速度1000rpm/min，时间5min。

7.根据权利要求1或6所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述胰蛋白酶溶液浓度为0.1～0.15％，优选0.125％。

8.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述加培养液重悬至细胞密度1.2-1.6×10⁵个/ml。

9.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述培养条件为温度37℃，CO₂浓度5％；所述重悬细胞接种于培养液培养24h后换液，再持续培养至细胞密度85～95％期间，每48h换液一次。

10.根据权利要求1或9所述提取方法，其特征在于：所述重悬细胞接种于培养液中培养至细胞密度达90％。

11.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述胰蛋白酶溶液的加入量为每5×10⁵个细胞加1ml胰蛋白酶；所述胰蛋白酶溶液浓度为0.2～0.3％，优选0.25％；所述消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落。

12.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述加培养液至覆盖培养容器底部；所述加培养液培养期间每2～3天换液一次。