[发明专利]一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法

说明书

本发明涉及一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，包括以下步骤：离线标定细胞核相对于极体的三维分布；通过三维有限元建模获得细胞核相对于微针位置的动态漂移轨迹；利用因析设计法确定细胞核位置动态漂移的主导影响因素；对微针胞内移动参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系进行拟合，确定接近细胞核所需的微针轨迹，由控制器控制微针沿确定的轨迹在胞内移动并接近细胞核并完成相应操作。利用本发明所述的细胞核操作方法，进行去核操作，可自动控制胞内运动轨迹及胞质去除量。相较人工去核操作，相同去核成功率下胞质去除量减少60％，家猪克隆胚胎卵裂率提升近一倍。

技术领域

本发明属于细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法。

背景技术

卵母细胞核操作被广泛应用于动物克隆和核转基因注射等操作中。进行卵母细胞核操作的前提为：将操作工具如微针移动到细胞核附近适合操作细胞核的位置，再进行后续操作。然而这一任务由于卵母细胞核一般不可见，并且微针在细胞内移动会造成细胞变形引起细胞核位置动态漂移而难以完成。

通过细胞核染色的方法对细胞核进行操作，虽然可以使细胞核可见，但是以此进行细胞核定位和微针的运动控制，由于荧光场下带来的光漂白，不仅会损害细胞活性，而且存在微针无法定位的问题，继而严重限制了荧光染色技术在细胞核操作中的应用。因此，确定一个不需要对细胞核染色，即可完成估计卵母细胞核位置及微针操作时细胞核动态漂移过程，进而确定微针在细胞内的运动轨迹并移动到细胞核附近适合位置对细胞核进行操作的方法十分有必要。

发明内容

本发明针对现有细胞核操作方法中存在的难以控制微针移动至细胞核附近适宜位置对细胞核进行操作的问题，提出了一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，该方法利用离线标定的方式确定细胞核相对极体的三维分布范围，来估计细胞核的初始位置范围，通过三维有限元建模与因析设计获得细胞核位置动态漂移轨迹及其主导影响因素，拟合微针胞内移动轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的曲线关系，确定移动微针至细胞核附近适宜位置操作细胞核所需要的微针轨迹，最后对胞内微针进行运动控制使其沿设定轨迹运动到既定位置完成细胞核操作。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，该方法包括以下步骤：

S1，在离线条件下对荧光染色细胞核进行三维定位，并与在明场下确定的极体三维位置进行对比，确定细胞核相对于极体的三维分布；

具体地，在进行极体定位之前，对胞质进行轮廓检测，并计算轮廓区域的聚焦测度F，公式如下：

其中，μ为胞质轮廓区域的平均灰度值，N为胞质轮廓区域的像素数量，I(x,y)为坐标(x,y)处像素的灰度值，焦平面的高度由聚焦测度的极大值确定；通过细胞拨动将极体从不可见的初始位置转动到焦平面上来，拨动过程中通过极体轮廓检测算法获得极体的轮廓，极体轮廓面积取得极大值时认为极体已经移动到焦平面上，此时极体的轮廓中心被定义为极体在水平方向的位置，焦平面的高度为极体在深度方向上的位置。

细胞核三维位置在荧光场下进行定位，细胞核的深度位置通过细胞核自动聚焦方法确定，聚焦过程中实时计算荧光场中细胞核轮廓面积，在聚焦状态下由于离焦导致的轮廓虚影最小，轮廓面积的极小值用来确定细胞核的深度位置，细胞核的水平位置由聚焦时细胞核轮廓中心点的坐标确定。

最后，根据测得的细胞核与极体的三维位置获得细胞核相对极体的三维分布。细胞核相对极体的三维分布范围以通过覆盖分布区域90％以上的采样点的外接椭球边界确定；由于极体在焦平面上，细胞核相对于极体分布在Y方向和Z方向是对称的，因此用细胞核中心到细胞中心-极体中心的连线的距离作为除了X方向之外的细胞核相对于极体分布的另一个变量，将细胞核关于极体的分布转化为二维分布，从而用曲面拟合获得其概率分布函数。