[发明专利]一种印楝素合成前体的底盘生产菌株WHY-60

说明书

本发明旨在提供一种生产印楝素合成前体的底盘生产菌株，利用同源重组的方法将不同来源的前体合成相关基因整合到酵母基因组上，同时诱导表达印楝来源的印楝素骨架化合物的合成基因，最终获得印楝素合成前体的底盘生产菌株。

技术领域

本发明涉及一种印楝素合成前体的底盘生产菌株，属于生物工程技术领域。

背景技术

印楝素是来源于植物印楝的一种三萜类次级代谢产物，具有极强的杀虫活性及医药价值，市场前景巨大。目前以印楝素为原料的杀虫产品因其杀虫谱广，对环境无污染，安全无害等特点，在美国，印度及中国等国家使用广泛。现有的印楝素主要生产方法为植物提取方法，即从印楝素含量最高的印楝种子中提取印楝素，供应市场需求。该方法生产过程步骤复杂，使用的提取试剂对环境危害大且受制于原料的地域分布，因此并不能满足日益增长的市场需求。

合成生物学及基因操作技术的快速发展为天然产物的异源合成及底盘宿主开发提供了强有力工具。将来源于不同物种的基因进行重新组合与优化，并在微生物中构建新的合成途径，优化胞内代谢流向，诱导印楝素合成前体的关键基因的表达，使细胞具有合成印楝素前体的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建印楝素合成前体的底盘生产菌株的方法，通过过表达不同来源的印楝素前体2,3-氧化鲨烯合成途径中的基因，使得细胞内2,3-氧化鲨烯的产量增加；同时为进一步提高前体产量，利用同源重组方法将过表达的合成途径中的关键基因整合到酵母细胞的基因组；同时在此菌株中诱导表达从印楝转录组数据中获得的印楝素骨架化合物合成关键基因OSC，最终构建了印楝素合成前体的底盘生产菌株。按照本发明提供的技术方案，一种构建印楝素合成前体的底盘生产菌株方法，采用以下方法步骤：

1.利用OEPCR方法将不同来源的基因进行组装成基因表达盒。

2.将步骤1中人工合成的基因表达盒与质粒载体连接，将连接产物化转至酵母细胞中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到表达质粒，取阳性子进行发酵验证。

3.将酵母细胞制备感受态，利用同源重组的方法将不同来源的前体合成相关基因表达盒整合到酵母基因组上，利用尿嘧啶缺失型平板进行整合菌株的筛选。

4.将步骤3中转化得到的单菌落逐个转接进行基因组的提取，利用PCR方法对单菌落进行筛选，获得整合基因表达盒的阳性转化子。

5.将印楝来源的印楝素合成关键中间体相关基因OSC与表达质粒pRS313质粒连接，使用Gibson连接方法构建表达质粒，并将表达质粒转化到第4步获得的阳性转化子中，诱导该基因的表达，结果如图1所示，最终获得印楝素合成前体的底盘生产菌株WHY-60。

附图说明

图1一种印楝素合成前体的底盘宿主菌株的构建。

图2印楝素合成途径。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、一种印楝素合成前体的底盘生产菌株WHY-60的构建。

通过OEPCR方法将不同来源的2,3-氧化鲨烯合成途径中涉及的关键基因进行克隆组装成基因表达盒，并与表达质粒骨架pRS313相连，构建对应的前体表达质粒，并转化到酵母细胞内进行发酵验证。

利用同源重组的方法将上述构建好的基因表达盒整合到酵母基因组上，构建高产2,3-氧化鲨烯的底盘宿主。

利用反转录PCR方法从印楝中克隆得到催化印楝素合成骨架化合物的关键基因OSC，如图2所示，并利用Gibson连接的方法构建该基因能的表达载体，转化到上一步中获得的酵母菌株中，诱导该关键基因的表达，获得印楝素合成前体的底盘生产菌株WHY-60。