[发明专利]一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法

说明书

本发明公开了一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法，在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X‑100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM‑FF柱上复性和稀释复性纯化得到了肌钙蛋白I的标准物质。其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30‑第110的氨基酸序列片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No：1所示。本发明采用了一种新方法实现了对肌钙蛋白I标准物质的制备，解决了肌钙蛋白不稳定的问题。该标准物质可在低温条件下保持长期稳定，满足国家一级标准物质的要求。该标准物质为肌钙蛋白序列的稳定片段，能够覆盖市面上多数试剂盒的抗原表位要求。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法。

背景技术

心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin，cTn)是心肌细胞的收缩调节蛋白，由Ca²⁺结合亚基肌钙蛋白C(cTnC)、原肌球蛋白结合亚基肌钙蛋白T(cTnT)、抑制亚基肌钙蛋白I(cTnI)三种亚基组成复合体，调节粗、细肌丝之间的相对滑行，从而调节肌肉收缩。心肌受损时，三个亚基被释放至细胞外，并可在外周血中检测出来，心肌肌钙蛋白是心肌损伤的特异性标志物，是心肌梗死的金指标。

心肌肌钙蛋白T的试剂盒已经由罗氏公司垄断，不存在一致化的问题。但是文献报道，仅美国FDA就至少批准了15家以上的厂家生产肌钙蛋白I检测试剂盒，不同厂家的试剂盒检测同一样本结果的差异甚至可达到100倍。美国标准化研究院NIST与美国临床化学委员会(AACC)早在2001年就成立了肌钙蛋白I标准化委员会来专门做肌钙蛋白I的标准化。2005年美国NIST研制出了人心肌来源的肌钙蛋白标准物质SRM2921，在当时为肌钙蛋白I的标准化做出了很大的贡献。但是随着用户的使用，越来越多的文章报道该标准物质会随着保存时间的推移和温度的变化而不稳定。

中国计量科学研究院对肌钙蛋白I不稳定的问题，重组了肌钙蛋白I的稳定片段序列，并经过纯化得到了肌钙蛋白I的标准物质候选物。由于目前国内尚未研制出肌钙蛋白I的标准物质，且缺乏相关的检测参考方法，因此肌钙蛋白I检测的标准化无法实现，导致许多研究结果截然不同甚至互相矛盾。因此准确定量测定体液中的肌钙蛋白I的含量并建立其定量量值体系在肌钙蛋白I的临床检验和疾病的诊断中有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。本发明明确被测物质，实现对待测物质的范围划定；简化了蛋白质前处理步骤，消除了过程中引入的其他变量和由此导致的不确定度；不选用特征肽段进入质谱的检测方法，消除了由于异质性而产生的质荷比改变所产生的结果差异；不选用制备过程复杂表征困难的同位素标记的重组cTnI作为内标，简化了实验方案。本发明利用同位素稀释质谱法准确定量重组肌钙蛋白I，建立其标准定值体系，使检测结果可溯源至SI。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

针对肌钙蛋白I不稳定的问题，在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X-100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM-FF柱上复性和稀释复性纯化cTnI，得到了肌钙蛋白I的标准物质；其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30-第110氨基酸序列的片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No:1所示。所述cTnI稳定片段氨基酸序列如SEQ No:2所示。具体包括以下步骤：

(1)人血清样本准备；

(2)稳定心肌肌钙蛋白I标准物质的制备：1)重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选；2)重组人cTnI的IPTG诱导表达；3)重组人cTnI包涵体蛋白的裂解，洗涤；4)重组人cTnI的纯化。