[发明专利]一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇

权利要求书

1.一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇，其特征在于，由以下方法制备获得：

(1)红细胞表面修饰上CTC靶向的叶酸或抗体

第一类：叶酸修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-FA的PBS溶液混合均匀，在4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞；或者，

第二类：可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-biotin的PBS溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞；将biotin修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为100ug/mL的SA溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰SA的红细胞；最后将SA修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为5ug/mL的生物素化的CTCs靶向抗体溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰CTCs靶向抗体的红细胞；

(2)红细胞表面聚凝胺的修饰

将10μL～50μL表面修饰上FA或CTC靶向的抗体的红细胞与100μL～500μL的浓度为1～100mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合，在4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与FA或CTCs靶向抗体的红细胞，将其分散至PBS溶液中备用；

(3)红细胞团簇的制备

将具有表面修饰基团的微球用PBS洗涤三遍，再加入100倍以上微球计数个数的步骤(2)的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以300g～600g的离心速度离心1min～30min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育20min～2h，最后将离心管底部的混合物吹散后，用孔径为10μm的生物相容性微孔膜过滤悬液；过量的游离红细胞、未形成红细胞团簇的微球和小于10μm的缺陷红细胞团簇可以通过过滤去除；最后从膜上收集到尺寸超过10μm的红细胞团簇。

2.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、前列腺特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、前列腺特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的DSPE-PEG-FA或者DSPE-PEG-biotin的分子量为5000。

5.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述微球表面的修饰基团为羧基或者氨基。

6.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述表面修饰基团的微球的直径为5～6μm。

7.权利要求1-6任一项所述的红细胞团簇在制备识别、捕获或富集循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用。