[发明专利]一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法

说明书

本发明提供了一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，旨在明确JUN基因在鸡雌性分化中的作用，为探明鸡的性别分化及性别控制技术奠定理论和实践基础。本方法适用于鸡性别基因的筛选和验证，验证结果合理准确，实验过程严密周谨。本发明可以证明JUN基因是鸡雌性性别决定的关键调控因子，在雌性分化过程中发挥重要作用。可用于禽类性别决定基因的筛选和验证，本研究为鸡性别控制技术提供了理论支撑，在鸡的养殖业最大化经济效益中奠定基础。此外，本发明中的性别基因筛选和验证方法也可以应用于其他禽类及动物研究中，具有很好的生产和科学研究意义。

技术领域

本发明涉及一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，属于生物技术领域。

背景技术

禽类性别直接影响着经济效益，蛋禽生产中，母鸡的生产效益远高于公鸡，而肉禽生产中在公鸡生长速度明显地大于母鸡，价格差异甚远。所以人工控制鸡性别比例能够优化鸡群结构，节省饲养成本。为了能准确容易而准确地鉴别鸡的雌雄性别，Embrex公司设计测定鸡胚尿囊液中雌激素水平鉴别雌雄的商业化模型，Grifiths等根据鸡W染色体上的一段特异序列利用PCR技术进行鸡胚早期性别鉴定。尽管研究者通过多种手段提高性别鉴定的准确性和实用性，但均因为成本较高且程序繁琐而未能推广应用。因此在雌性性别分化关键调控因子的探索尚存在空缺和不足。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法。

本发明的目的是这样实现的，一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN，qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异；

(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射；

(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。

步骤(1)中，首先从RNA-seq数据中筛选得到在两性ESCs和PGCs中差异表达的关键基因JUN，通过qRT-PCR检测JUN在0-18.5d的鸡胚发育过程中的表达变化趋势，Real-timePCR反应总体积20μL，含2μL模板，10μL 2×SuperReal Color PreMix，0.6μL上下游引物，6.8μLH2O；在PCR仪上进行反应，结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。

所述在PCR仪上进行反应时，条件为：

95℃预变性15mins；95℃10s、55℃30s、72℃32s，共40个循环；循环结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。

步骤(2)中，将pCDH CMV-MCS-EF1-TagRFP+Puro载体和JUN的CDS区模板分别进行XbaI和NotI位点的双酶切，回收片段后通过T4连接酶连接构建得到OE-JUN载体；根据JUN的CDS区设计三个干扰靶点，插入gatcc-TTCAAGAGA-TTTTTTg序列合成上下游反向互补的oligo片段，退火连接后与pGMLV-SC5质粒连接，形成重组干扰载体sh-JUN；分别将构建成功的OE-JUN和sh-JUN载体转化感受态细胞挑取阳性菌落送测验证；测序成功的载体转染到培养至70％汇合度的DF1细胞内，48h之后收取细胞qRT-PCR检测JUN表达，选取活性最强的载体交由慢病毒包裹后，在2.5d鸡胚体内血管注射。