[发明专利]一种自然杀伤细胞的培养方法

权利要求书

1.一种自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)包被：用Erb-B2(酪氨酸激酶受体2)作为包被液预先包被培养容器底部；

(二)培养：用激活培养液A重悬外周血单个核细胞(PBMC细胞)，置于上述预先包被的培养容器中，转移至培养箱中培养；培养第3～5天，补加1～2次活化培养液B，培养第7～8天补加扩增培养液C，之后每2～3天补加一次扩增培养液C；共培养14～21天；

所述激活培养液A，是由基础培养液、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和NK细胞外泌体组成的，其中，IL-15的浓度为80～120ng/ml，IL-18的浓度为80～120ng/ml，IL-21的浓度为80～120ng/ml，IL-27的浓度为80～120ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为0.8～1.2×10⁶个/ml；

所述活化培养液B，是由基础培养液和IL-15组成的，IL-15的浓度为80～120ng/ml；

所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL-2组成的，IL-2的浓度为450～550ng/ml；

所述基础培养液选自淋巴细胞无血清培养液。

2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(一)用Erb-B2作为包被液预先包被培养容器底部的具体方式为：取培养容器，加入Erb-B2包被液，轻轻摇晃，使溶液在培养容器底部扩散，铺满瓶底；4℃下保存，备用；使用前移出包被液，用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)洗涤培养容器。

3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述PBMC细胞，是通过以下方式提取得到的：向采集的外周血中加入适量PBS缓冲液进行稀释，加入适量淋巴细胞分离液，离心分层，分为四层：血浆层，单个核细胞层，分离液层，多形核白细胞和红细胞层；吸取单个核细胞层，加入适量PBS缓冲液，离心，得PBMC细胞，备用。

4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(二)中，在培养箱中培养的具体条件为：37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度。

5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(二)培养的具体方式为：

(1)用激活培养液A重悬PBMC细胞，调整细胞密度至0.6×10⁶～1.2×10⁶cells/mL，转移至二氧化碳培养箱中培养；

(2)培养第3天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×10⁶～1.2×10⁶cells/mL；

(3)培养第5天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×10⁶～1.2×10⁶cells/mL；

(4)培养第7天，加入扩增培养液C，调整细胞密度至1.5×10⁶cells/mL，此后每两天补液一次，连续培养14～21天。

6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述激活培养液A中IL-15、IL-18、IL-21、IL-27的浓度均为100ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为1.0×10⁶个/ml；

或/和：所述活化培养液B中IL-15的浓度为100ng/ml；

或/和：所述扩增培养液C中IL-2的浓度为500ng/ml。

7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述基础培养液选自Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。