[发明专利]单B细胞筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用

说明书

本发明公开了单B细胞筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用。过改造小分子使其具有活泼基团(即半抗原)，并与对应的荧光素进行化学偶联，分离纯化后得到半抗原‑荧光素的复合物；将所述复合物标记(人工抗原)免疫后的B细胞，作为待筛选细胞；使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。本发明还提供利用筛选得到的B细胞在小分子单克隆抗体制备中的应用。本发明通过半抗原‑荧光素标记特异性B细胞，利用流式细胞仪进行快速分选，提前对融合的细胞进行筛选，去除了识别载体蛋白的B细胞，大大提高了识别小分子的B细胞的阳性率。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地说，涉及单B细胞筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用。

背景技术

传统的抗体制备是将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，再采用有限稀释法经过多轮筛选从而获得能产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。但从脾细胞分离的B细胞并非都能有效的用于融合，有效融合比例仅为1:10⁵-10⁶，而融合后的杂交瘤细胞也仅有极少部分可分泌抗原特异性抗体。尤其在进行小分子半抗原免疫时，更有相当一部分是针对载体蛋白或“桥链”而非小分子本身。

本发明基于流式细胞术对小鼠特异性B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行高效筛选并建立了快速高效的单克隆抗体制备方法。采用半抗原-荧光标记物富集抗原特异性B细胞，通过流式细胞仪分选去除载体蛋白和桥链抗体的影响，达到对阳性细胞的精准筛选，提高有效融合效率，实现高性能抗体的精准制备。

发明内容

本发明的目的是提供单B细胞筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用。

本发明的另一目的是提供毒鼠强特异性抗体及应用。

本发明构思如下：通过改造小分子使其具有活泼基团(即半抗原)，并与对应的荧光素进行化学偶联，分离纯化后得到半抗原-荧光素的复合物；将所述复合物标记(人工抗原)免疫后的B细胞，作为待筛选细胞；使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。进一步地，将上述筛选方法获得的B细胞用于小分子单克隆抗体的制备。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种B细胞筛选方法，包括：

1)针对小分子化合物A，设计具有活性基团的半抗原，将半抗原与荧光素进行化学偶联，得到半抗原-荧光素复合物；

2)将步骤1)的半抗原与载体蛋白偶联得到人工抗原；

3)用人工抗原免疫实验动物，采血，分离得到外周血单核细胞；

4)用步骤1)的半抗原-荧光素复合物标记外周血单核细胞，然后利用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到可特异性识别小分子化合物A的B细胞。

所述小分子化合物A可以是毒鼠强(TETS)。

优选地，毒鼠强半抗原的结构如式I)所示：

式I)所示的毒鼠强半抗原可参见CN109608479A。

所述荧光素可以是5-氨基荧光素、6-氨基荧光素。。

所述载体蛋白可选自牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白或血蓝蛋白。

毒鼠强半抗原-荧光素复合物的结构如式II)所示：

进一步地，可采用如下方法制备式II)化合物：

(1)将式I)所示的毒鼠强半抗原43mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)80mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)60mg加入到上述毒鼠强半抗原溶液中，室温搅拌反应2h，得到活化的毒鼠强半抗原溶液；